Y187 感受(shou)態細(xi)胞(bao)100ul*50​

Y187 感受(shou)態細(xi)胞(bao)100ul*50​ 操(cao)作方(fang)法(fa)（以下操(cao)作均(jun)按(an)無菌(jun)條(tiao)件(jian)的(de)標(biao)準(zhun)進行(xing)）
1 取感(gan)受(shou)態細(xi)胞(bao)置(zhi)於(yu)冰浴(yu)中(zhong)，如需(xu)分裝可(ke)將剛(gang)融(rong)化(hua)細(xi)胞(bao)懸液分裝到(dao)無菌(jun)預(yu)冷(leng)的(de)離心(xin)管(guan)中，置(zhi)於(yu)冰浴(yu)中(zhong)。
●  壹次(ci)轉(zhuan)化(hua)感受(shou)態細(xi)胞(bao)的建議用量(liang)為50-100 μl，可(ke)以根據實(shi)際(ji)情(qing)況(kuang)分裝使(shi)用。應(ying)註意所(suo)用DNA 體積(ji)不(bu)要(yao)超過(guo)感(gan)受(shou)態細(xi)胞(bao)懸液體積(ji)的(de)十(shi)分之(zhi)壹。
以下實驗(yan)以100 μl感受(shou)態細(xi)胞(bao)為例。
Y187 感受(shou)態細(xi)胞(bao)100ul*50​ 2 向(xiang)感(gan)受(shou)態細(xi)胞(bao)懸液中加入目的(de)DNA（100 μl 的(de)感受(shou)態細(xi)胞(bao)能夠被1 ng 超螺(luo)旋(xuan)質粒DNA 所(suo)飽(bao)和），輕(qing)輕(qing)旋(xuan)轉(zhuan)離(li)心管(guan)以混勻內(nei)容(rong)物，在(zai)冰浴(yu)中(zhong)靜(jing)置(zhi)30 分鐘。
3 將(jiang)離心(xin)管(guan)置(zhi)於(yu)42℃水(shui)浴(yu)中(zhong)放置(zhi)60-90 秒(miao)，然後快速(su)將管(guan)轉(zhuan)移(yi)到(dao)冰浴(yu)中(zhong)，使細(xi)胞(bao)冷(leng)卻(que)2-3 分鐘，該(gai)過程(cheng)不(bu)要(yao)搖(yao)動(dong)離(li)心(xin)管(guan)。
4 向(xiang)每個離心(xin)管(guan)中加入900 μl 無菌(jun)的(de)SOC 或(huo)LB 培(pei)養(yang)基(ji)（不(bu)含(han)抗(kang)生素(su)）， 混勻後置(zhi)於(yu)37℃搖(yao)床振(zhen)蕩培(pei)養(yang)1 小時（160-220 轉(zhuan)/分鐘），目(mu)的是(shi)使(shi)質粒上(shang)相(xiang)關的抗(kang)性(xing)標(biao)記基(ji)因表(biao)達，使菌(jun)體復蘇。
5 將(jiang)離心(xin)管(guan)內容物混勻，吸(xi)取(qu)100 μl 已轉(zhuan)化(hua)的感受(shou)態細(xi)胞(bao)加到(dao)含(han)相應(ying)抗(kang)生素(su)的SOB 或LB 固(gu)體瓊脂培(pei)養(yang)基(ji)上(shang)，用無菌(jun)的(de)彎頭玻(bo)棒輕(qing)輕(qing)的將(jiang)細(xi)胞(bao)均(jun)勻塗開(kai)。將平板(ban)置(zhi)於(yu)室溫(wen)直至(zhi)液體被吸(xi)收(shou)，倒(dao)置(zhi)平板(ban)，37℃培(pei)養(yang)12-16 小時。
Y187 感(gan)受(shou)態細(xi)胞(bao)100ul*50​ ●  塗布用量(liang)可根(gen)據(ju)具體實驗(yan)來調(tiao)整(zheng)。如(ru)轉(zhuan)化(hua)的DNA 總量較(jiao)多(duo)，可(ke)取(qu)更少量(liang)轉(zhuan)化(hua)產物塗布平板(ban)；反(fan)之(zhi)，如轉(zhuan)化(hua)的DNA 總量較(jiao)少，可(ke)取200-300 μl 轉(zhuan)化(hua)產物塗布平板(ban)。如(ru)果預(yu)計(ji)的克隆(long)較(jiao)少，可(ke)通過離心（4,000 rpm, 2分鐘）後吸(xi)除部分培養(yang)液(ye)，懸(xuan)浮菌(jun)體後將其塗布於(yu)壹個(ge)平板(ban)中(zhong)。（塗布剩(sheng)余的(de)菌(jun)液(ye)可(ke)置(zhi)於(yu)4℃保存(cun)，如(ru)果次(ci)日(ri)的轉(zhuan)化(hua)菌(jun)落(luo)數(shu)過少可(ke)以將剩(sheng)下的(de)菌(jun)液(ye)再塗布新(xin)的(de)培養(yang)板(ban)）
 註意事(shi)項
1. 感(gan)受(shou)態細(xi)胞(bao)應(ying)保存(cun)在(zai) -70℃，不(bu)可(ke)多(duo)次(ci)凍(dong)融(rong)和放(fang)置(zhi)時(shi)間過(guo)長，以避免降(jiang)低感(gan)受(shou)態細(xi)胞(bao)的轉(zhuan)化(hua)效率(lv)。
2. 進行(xing)轉(zhuan)化(hua)操(cao)作時(shi)，應(ying)根(gen)據相應(ying)溫(wen)度及(ji)無菌(jun)條(tiao)件(jian)的(de)要(yao)求進(jin)行(xing)。
3 為防(fang)止轉(zhuan)化(hua)實驗(yan)不(bu)成(cheng)功(gong)，可(ke)以保留部分連(lian)接(jie)反(fan)應(ying)液(ye)，以重(zhong)新(xin)轉(zhuan)化(hua)，將損失降(jiang)到(dao)低。
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