聚(ju)合酶(mei)鏈(lian)反應(PCR)技術是在體外(wai)進行(xing)的由(you)引物介(jie)導(dao)的酶促(cu)DNA擴(kuo)增(zeng)反應。PCR的原理(li)是在模板(ban)DNA、PCR引物(wu)、四種(zhong)脫(tuo)氧(yang)核(he)糖(tang)核(he)苷(gan)酸(dNTP)及適(shi)當濃(nong)度的Mg2+存(cun)在的條件下，依(yi)賴於DNA聚(ju)合酶(mei)的體外(wai)酶促(cu)合(he)成反應。兩個引物(wu)分別位於靶序(xu)列(lie)兩端，同兩條模板(ban)的3’端互補，由(you)此限定(ding)擴(kuo)增(zeng)片段。PCR反應由(you)壹系(xi)列(lie)的變(bian)性→退火→延伸(shen)反復循環構(gou)成，即(ji)在高溫(wen)下模板(ban)雙鏈(lian)DNA變(bian)性解(jie)鏈(lian)，然後(hou)在較低(di)溫(wen)度下同(tong)過(guo)量(liang)引(yin)物退火，再在適中(zhong)溫(wen)度(du)下由(you)DNA聚(ju)合酶(mei)催化(hua)進行(xing)延伸(shen)。理(li)論(lun)上(shang)，經(jing)過(guo)N次(ci)循環可(ke)使(shi)特定(ding)片段擴(kuo)增(zeng)到(dao)2n-1，考慮(lv)到(dao)擴增(zeng)效率(lv)達不到(dao)100%，所(suo)以(yi)通(tong)常(chang)經(jing)25到(dao)30次(ci)循環可(ke)擴(kuo)增(zeng)到(dao)106倍，足夠後(hou)續實(shi)驗展(zhan)開(kai)。下面(mian)分享提高PCR反應的特異(yi)性方法(fa)：

1、巣(巣)式(shi)pcr（Nest-PCR）可(ke)增(zeng)加稀有靶序(xu)列(lie)的靈敏(min)度(du)；降低(di)了(le)擴(kuo)增(zeng)多個靶位點的可(ke)能(neng)性；提高PCR特異(yi)性2、遞減(jian)PCR（Touch Down  PCR）：前(qian)幾(ji)個循環使(shi)用嚴謹(jin)的退火條件提高特異(yi)性；循環設在比估算的Tm高大(da)約5℃的退火溫度(du)下開(kai)始，然後(hou)每(mei)個循環降低(di)1-2℃，直(zhi)到(dao)退火溫度(du)低於Tm  5℃ 。適合(he)用(yong)於AFLP、DNA指紋分析(xi)等(deng)。

3、熱(re)啟(qi)動PCR：抑制壹種(zhong)基本成分延遲(chi)DNA合(he)成，直(zhi)到(dao)PCR儀到(dao)達變(bian)性溫度(du)。如在冰上(shang)配制PCR反應液以抑(yi)制Taq酶(mei)活性，後(hou)將其(qi)置(zhi)於預熱的PCR儀中(zhong)。

4、使(shi)用PCR增(zeng)強劑：甲酰(xian)胺(an)，DMSO，甘油，甜(tian)菜堿等(deng)可(ke)以(yi)降低(di)熔(rong)解(jie)溫(wen)度(du)，有助(zhu)於引物(wu)退火，輔(fu)助(zhu)DNA聚(ju)合酶(mei)延伸(shen)通(tong)過(guo)二級結構(gou)區(qu)。但是增(zeng)強劑的濃(nong)度要(yao)適當。

5、可(ke)使(shi)用engreen的PCR試劑，添加改良的DNA聚(ju)合酶(mei)，大(da)大(da)提高擴(kuo)增(zeng)產(chan)物的特異(yi)性和保(bao)真(zhen)性。