T4 UvsX Recombinase

公(gong)司產品(pin)僅(jin)供(gong)科(ke)研(yan)研(yan)究使用、不得(de)用於臨床診(zhen)斷(duan)！

商(shang)品屬(shu)性

產品(pin)介紹(shao)：

UvsX 重組酶(mei)，來源於(yu) T4 噬菌(jun)體(ti)，是(shi) RecA/Rad51家族(zu)的(de)同源(yuan)體(ti)。RecA/Rad51 重組酶(mei)家族(zu)在(zai)雙鏈(lian) DNA 斷裂(lie)的(de)無誤修(xiu)復(fu)和復(fu)制(zhi)叉重新啟(qi)動(dong)的(de)過程(cheng)中起到重要(yao)作用(yong)。
T4 UvsX 重組酶(mei)可(ke)與(yu)其他重組酶(mei)壹(yi)起錨定(ding)在(zai)單鏈(lian) DNA 上(shang)並激(ji)活其在(zai)其他雙(shuang)鏈 DNA 上尋找(zhao)同(tong)源(yuan)序(xu)列(lie)，以(yi)進壹(yi)步完(wan)成鏈置換(huan)。經(jing)檢測(ce)，該酶(mei)無核酸(suan)酶活(huo)性。

儲(chu)存(cun)：

置(zhi)於-20°C 可(ke)保(bao)存 1 年(nian)，-80°C 長(chang)期保(bao)存，短期使(shi)用(yong)置(zhi)於(yu) 4°C，保(bao)存壹(yi)個月(yue)，避(bi)免(mian)反(fan)復(fu)凍融(rong)。
熱(re)失(shi)活：60°C，10min。
酶(mei)儲存液：50 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1 mM DTT, 0.1 mM
EDTA, 10% Trehalose, pH 7.5。2xRPA BufferMix：包含反(fan)應緩沖鹽(yan)、ATP、磷酸(suan)肌(ji)酸(suan)、dNTP、PEG、DTT、BSA 等，可(ke)用於 RPA 擴增試驗(yan)。該(gai)試劑(ji) 4°C
條件(jian)下放(fang)置(zhi) 1 個月(yue)性(xing)能(neng)無下降。
基(ji)於(yu)本(ben)蛋(dan)白進行(xing) RPA 反應測(ce)試的(de)全套(tao)試劑(ji)

用於 RPA 擴(kuo)增的(de)測(ce)試引(yin)物(wu)與(yu)探(tan)針(zhen)
CPV-F（20uM） CACTTACTAAGAACAGGTGATGAATTTGCTACAG
CPV-R（20uM） AGTTTGTATTTCCCATTTGAGTTACACCACGTCT
Probe（10uM） CCTCAAGCTGAAGGAGGTACTAACTTTGGT[dT-BHQ1]
[THF][dT-FAM]ATAGGAGTTCAACAAG -(C3)
Canine parvovirus type 2,VP2
加(jia)入(ru) 1μl 的(de)模板(ban) DNA，上(shang)機(ji)反(fan)應(ying)前加(jia)入(ru) 1.25 μl 的(de) 280 mMMg(OAC)2（終(zhong)濃度(du) 14 mM），總(zong)反(fan)應體(ti)積(ji) 25 μl。混(hun)合(he)均勻，並離(li)心，置於(yu) 39-42℃條(tiao)件(jian)下反應(ying) 30min。
2. 進行(xing)熒光 RPA 擴增在(zai)進行(xing)熒光檢測(ce)時體(ti)系中，額(e)外加(jia)入(ru) 0.3 μl 的(de) 10μM Probe（120 nM的(de)終(zhong)濃度(du)）和 50U 的(de) Exonuclease III（2U/μl 的(de)終(zhong)濃度(du)），即(ji)可進行(xing)熒光檢測(ce)。本(ben)方法(fa)應用原(yuan)理為(wei) ExoIII 切割(ge) THF 位點(dian)，使熒光與(yu)猝(cu)滅基團(tuan)分(fen)離(li)，報告熒光信號。
特別說(shuo)明：
（1） 以(yi)上(shang) RPA 擴增測(ce)試屬(shu)於蛋(dan)白功能(neng)性測(ce)試，按(an)照(zhao)以(yi)上(shang)實驗(yan)操(cao)作流(liu)程，可(ke)獲(huo)得(de) RPA 擴增產物(wu)。進壹(yi)步的(de)優化(hua)，包括：X、Y、GP32、聚(ju)合(he)酶、反應(ying) Buffer，甚至加(jia)樣(yang)順序，均(jun)可(ke)能進壹(yi)步提高 RPA 的(de)擴增性(xing)能(neng)。
（2）關(guan)於(yu) DNA 聚合(he)酶的(de)選擇， 測(ce)試了三(san)種常(chang)見(jian)的(de) DNA聚合(he)酶，在(zai)進行(xing)熒光法(fa)測(ce)定(ding)時(shi)，推(tui)薦(jian)的(de)選擇順序依(yi)次(ci)為(wei) Bst 4.0>Bsu> Sau，且(qie)在(zai) 42℃條件(jian)下，總(zong)能(neng)獲(huo)得(de)最(zui)快的(de)擴增速度(du)，且(qie)熒光信號更強(qiang)。在(zai) Basic 擴增中 Sau 表(biao)現(xian)出特異性(xing)擴增能(neng)力(li)更佳。
（3）關(guan)於(yu) RPA 的(de)靈敏(min)度(du)與(yu)非(fei)特異擴(kuo)增，在(zai) Basic 試劑(ji)的(de)擴增中，仍(reng)然存在(zai)非(fei)特異擴(kuo)增產物(wu)，這需(xu)要(yao)進壹(yi)步優化(hua)反應(ying)組分(fen)及(ji)引(yin)物(wu)序(xu)列(lie)。在(zai)使用(yong)熒光探針法(fa)時，但由(you)於特異性(xing)探針(zhen)的(de)存在(zai)，非(fei)特異擴(kuo)增產物(wu)通常無(wu)熒光信號值，但此時會影響檢測(ce)靈敏(min)度(du)。GP32 蛋(dan)白的(de)
濃度(du)增加(jia)會顯著降低(di)非(fei)特異性(xing)擴增，但(dan)會導(dao)致擴(kuo)增速度(du)減(jian)緩，此時需(xu)要(yao)同(tong)步增加(jia) X 與(yu) Y 蛋(dan)白的(de)用量(liang)，以(yi)維(wei)持 RPA 的(de)擴增速度(du)。
（4）據文(wen)獻(xian)報道，在(zai)進行(xing)試紙(zhi)條 RPA 實(shi)驗(yan)時(shi)，傾(qing)向使用(yong) Nfo 內(nei)切酶(mei)又(you)名 Endonuclease IV， 來對擴(kuo)增探(tan)針(zhen)進行(xing)切割(ge)，但  未予(yu)測(ce)試，目(mu)前(qian)無(wu)法(fa)提供相應參(can)數(shu)。
（5）RPA 反應 Buffer 對(dui)擴增至關(guan)重要(yao)，輕微(wei)的(de)濃度(du)差異，均可導(dao)致擴(kuo)增效(xiao)率(lv)大幅(fu)下降，甚至失(shi)敗。RPA BufferMix 為(wei)粘稠(chou)試劑(ji)，使用時(shi)務(wu)必保(bao)證加(jia)樣(yang)準(zhun)確，Tip 頭(tou)中的(de)殘(can)液務(wu)必打入 EP 管(guan)中。

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