ELISA的比(bi)色(se)測(ce)定由(you)酶標(biao)儀進(jin)行，有的同行可能會(hui)認為，既然(ran)由(you)酶標(biao)儀進(jin)行，那(na)麽此(ci)時(shi)便(bian)可(ke)以(yi)萬(wan)事(shi)大吉了(le)，其實(shi)不然(ran)，因(yin)為當(dang)代較為先(xian)進的(de)酶(mei)標(biao)儀器(qi)儀表(biao)，均(jun)有較多的功能，使(shi)用不(bu)當(dang)，會(hui)得(de)到令(ling)人難(nan)以(yi)理(li)解(jie)的(de)結果(guo)。如(ru)使用(yong)酶標(biao)儀比(bi)色(se)測(ce)定後(hou)，有許多(duo)陰(yin)性(xing)測(ce)定孔(kong)的吸光度(du)值為負數或(huo)測(ce)定假(jia)陽(yang)性(xing)率(lv)大大增加(jia)等等。這(zhe)主要是(shi)沒(mei)有正(zheng)確地(di)理(li)解(jie)和使(shi)用(yong)酶標(biao)儀所致(zhi)。至(zhi)於(yu)如(ru)何(he)正(zheng)確理(li)解(jie)和使(shi)用(yong)酶標(biao)儀詳見(jian)後面有關章節。此(ci)處(chu)，重點關(guan)註(zhu)點下(xia)面(mian)兩點：
1、比(bi)色(se)測(ce)定時(shi)，壹(yi)定要註(zhu)意(yi)酶(mei)標(biao)儀的(de)波(bo)長(chang)是(shi)否(fou)已調至(zhi)合適(shi)或(huo)所用(yong)濾(lv)光(guang)片(pian)是(shi)否(fou)正(zheng)確。由(you)於(yu)有的臨(lin)床實(shi)驗(yan)室(shi)在進(jin)行ELISA測(ce)定時(shi)，以(yi)TMB為底物(wu)和以(yi)OPD為底物(wu)的(de)試劑盒(he)均(jun)有使用，而(er)前(qian)者比(bi)色(se)波(bo)長(chang)為450nm，後(hou)者為492nm，濾(lv)光(guang)片(pian)需(xu)根據要求(qiu)隨時(shi)更(geng)換(huan)。因(yin)此(ci)，容易(yi)出現(xian)濾(lv)光(guang)片(pian)錯用的(de)問題(ti)。
2、單(dan)波(bo)長(chang)或(huo)雙波(bo)長(chang)比(bi)色(se)選(xuan)擇(ze)的(de)問題(ti)。中(zhong)檔以(yi)上(shang)的(de)酶標(biao)儀基本(ben)上(shang)都同時(shi)具(ju)有單(dan)波(bo)長(chang)和雙波(bo)長(chang)比(bi)色(se)功能。所謂(wei)的(de)單(dan)波(bo)長(chang)比(bi)色(se)即(ji)是(shi)通常(chang)的以(yi)對(dui)顯(xian)色(se)具(ju)有最大吸收的(de)波(bo)長(chang)如(ru)450nm或(huo)492nm進行比(bi)色(se)測(ce)定；而(er)雙波(bo)長(chang)雙色(se)則酶(mei)標(biao)儀在敏(min)感波(bo)長(chang)如(ru)450nm和非(fei)敏(min)感波(bo)長(chang)如(ru)630nm下各(ge)測(ce)定壹(yi)次(ci)，敏(min)感波(bo)上(shang)下(xia)的吸光度(du)測(ce)定值為樣本(ben)測(ce)定酶(mei)反應特(te)異顯(xian)色(se)的(de)吸光度(du)與(yu)板(ban)孔上(shang)指紋(wen)、刮(gua)痕(hen)、灰塵(chen)等臟(zang)物(wu)所致(zhi)的(de)吸光度(du)之和；非(fei)敏(min)感波(bo)長(chang)下(xia)測(ce)定即(ji)改變波(bo)長(chang)至(zhi)壹(yi)定值，使得(de)樣本(ben)測(ce)定酶(mei)反應特(te)異顯(xian)色(se)的(de)吸光度(du)值為零，此(ci)時(shi)測(ce)得(de)的吸光度(du)即(ji)為臟物(wu)的(de)吸光度(du)值。最後(hou)酶標(biao)儀給(gei)出的數值為敏感波(bo)長(chang)下(xia)的(de)吸光度(du)值與(yu)非(fei)常(chang)感波(bo)長(chang)下(xia)的(de)吸光度(du)值的差。因(yin)此(ci)，雙波(bo)長(chang)比(bi)色(se)測(ce)定具(ju)有能排(pai)除由(you)微(wei)滴板(ban)本(ben)身(shen)、板(ban)孔(kong)內(nei)標(biao)本(ben)的(de)非(fei)特(te)異(yi)吸收、指紋(wen)、刮(gua)痕(hen)、灰塵(chen)等對(dui)特異(yi)顯(xian)色(se)測(ce)定吸光度(du)的影(ying)響的優點，壹(yi)般(ban)不(bu)必設空白(bai)孔(kong)。如(ru)在使(shi)用雙波(bo)長(chang)比(bi)色(se)時(shi)，仍(reng)設空白(bai)孔(kong)，就可(ke)能會(hui)造成前面提到的(de)測(ce)定孔(kong)吸光度(du)為負數的(de)現(xian)象。由(you)於(yu)ELISA測(ce)定中(zhong)單(dan)個(ge)空白(bai)孔(kong)的非(fei)特異吸收上(shang)有壹(yi)定程(cheng)度(du)的不(bu)確定性(xing)，也就是(shi)說每(mei)次測(ce)定或(huo)同(tong)次測(ce)定空白(bai)孔(kong)位置(zhi)的不同均(jun)有可能得(de)到不(bu)同(tong)吸光度(du)測(ce)定值，故而(er)在ELISA測(ce)定比(bi)色(se)時(shi)，最(zui)好(hao)是(shi)使(shi)用雙波(bo)長(chang)比(bi)色(se)。