RT-PCR實(shi)驗(yan)RNA的(de)質量(liang)確認方(fang)法：

1、檢(jian)測(ce)RNA溶液的吸(xi)光度(du)

280、320、230、260nm下的吸(xi)光度(du)分(fen)別(bie)代(dai)表(biao)了(le)核(he)酸(suan)、背(bei)景(jing)（溶液渾濁度）、鹽(yan)濃(nong)度(du)和蛋白等有(you)機物(wu)的(de)值(zhi)。壹般(ban)的(de)，我們只看OD260/OD280（Ratio，R）。

1.82.0時(shi)，我們認為RNA中(zhong)蛋白或者(zhe)時其他(ta)有(you)機物(wu)的(de)汙(wu)染(ran)是可以容(rong)忍的，不(bu)過(guo)要(yao)註意，當(dang)妳(ni)用Tris作(zuo)為緩(huan)沖(chong)液檢測(ce)吸(xi)光度(du)時，R值(zhi)可能會大(da)於(yu)2（壹(yi)般應該是<2.2的(de)）。當(dang)R<1.8時(shi)，溶液中(zhong)蛋白或者(zhe)時其他(ta)有(you)機物(wu)的(de)汙(wu)染(ran)比(bi)較(jiao)明(ming)顯，妳可以根(gen)據自(zi)己(ji)的需(xu)要(yao)決(jue)定(ding)這份RNA的(de)命運(yun)。當(dang)R>2.2時(shi)，說明(ming)RNA已經水(shui)解成(cheng)單核(he)酸(suan)了。

如果RNA的量(liang)夠(gou)，可在(zai)260nm（A260）用分(fen)光光度(du)法測(ce)定(ding)RNA的(de)得率(lv)，1個(ge)單(dan)位等於40ug/mlssRNA。純RNA的A260/A280的比(bi)值(zhi)為2.0。A260/A230的比(bi)值(zhi)還表(biao)明(ming)RNA的純度，其值(zhi)小於(yu)2.0表明(ming)裂解液中(zhong)有(you)亞硫(liu)氰胍(gua)和belta-巰(巰)基乙醇殘留(liu)，其值(zhi)大(da)於(yu)2.4，需(xu)用乙酸(suan)鹽(yan)，乙醇沈澱RNA。

2、RNA的(de)電(dian)泳(yong)圖(tu)譜

壹(yi)般的(de)，RNA的(de)電(dian)泳(yong)都(dou)是用變性(xing)膠進(jin)行(xing)的(de)，但(dan)是根(gen)據我的(de)經驗(yan)，如(ru)果妳(ni)僅僅是為了(le)檢測(ce)RNA的質量(liang)是沒(mei)有(you)必要(yao)進(jin)行(xing)如(ru)此麻煩(fan)的實(shi)驗(yan)的(de)，用普(pu)通的瓊(qiong)脂(zhi)糖(tang)膠就可以了(le)。

電(dian)泳(yong)的(de)目(mu)的是在(zai)於檢測(ce)28S和18S條(tiao)帶(dai)的完整(zheng)性(xing)和他(ta)們的比(bi)值(zhi)，或者(zhe)是mRNA smear的(de)完整(zheng)性(xing)。壹般的(de)，如(ru)果28S和18S條(tiao)帶(dai)明(ming)亮、清晰、條(tiao)帶(dai)銳利(li)（指條(tiao)帶(dai)的邊緣清晰），並(bing)且28S的(de)亮(liang)度在(zai)18S條(tiao)帶(dai)的兩倍(bei)以上(shang)，我們認為RNA的(de)質量(liang)是好的(de)。

以上(shang)是我們常(chang)用的兩(liang)種(zhong)方(fang)法，但(dan)是這兩(liang)種(zhong)方(fang)法都無法明(ming)確的告訴(su)我們RNA溶液中(zhong)有(you)沒有(you)殘留(liu)的RNA酶(mei)。如(ru)果溶液中(zhong)有(you)非(fei)常(chang)微量(liang)的(de)RNA酶(mei)，用以上(shang)方(fang)法我們很難察覺(jiao)，但(dan)是大(da)部分(fen)後(hou)續(xu)的(de)酶(mei)學反(fan)應(ying)都(dou)是在(zai)37度(du)以上(shang)並(bing)且是長(chang)時(shi)間進(jin)行(xing)的(de)。這樣(yang)，如果RNA溶液中(zhong)有(you)非(fei)常(chang)微量(liang)的(de)RNA酶(mei)，那麽在(zai)後(hou)續(xu)的(de)實(shi)驗(yan)中(zhong)就會(hui)有(you)非(fei)常(chang)適(shi)合(he)的(de)環(huan)境(jing)和時間發揮(hui)它們的作(zuo)用了，當(dang)然(ran)這時(shi)妳的實(shi)驗(yan)也就(jiu)完(wan)了。

下面，我們介紹(shao)壹(yi)個可以確認RNA溶液中(zhong)有(you)沒有(you)殘留(liu)的RNA酶(mei)的(de)方(fang)法。

3、保(bao)溫(wen)試(shi)驗(yan)

方(fang)法很簡(jian)單的(de)，按(an)照(zhao)樣(yang)品濃(nong)度(du)，從RNA溶液中(zhong)吸取兩(liang)份1000 ng的(de)RNA加入(ru)至(zhi)0.5 ml的離(li)心管中(zhong),並(bing)且用pH7.0的Tris緩(huan)沖(chong)液補(bu)充到10 ul的(de)總(zong)體(ti)積(ji)，然(ran)後(hou)密閉(bi)管蓋(gai)。把其中(zhong)壹份放(fang)入(ru)70℃的恒溫(wen)水(shui)浴(yu)中(zhong),保(bao)溫(wen)1 h。另(ling)壹份放(fang)置(zhi)在(zai)-20℃冰(bing)箱中(zhong)保(bao)存1 h。

時(shi)間到了(le)之(zhi)後(hou)，取出(chu)兩份樣(yang)本進(jin)行(xing)電(dian)泳(yong)。電(dian)泳(yong)完(wan)成(cheng)後(hou)，比(bi)較(jiao)兩者(zhe)的電(dian)泳(yong)條(tiao)帶(dai)。如果兩(liang)者(zhe)的條(tiao)帶(dai)壹致或(huo)者(zhe)無明(ming)顯差(cha)別(bie)（當(dang)然(ran)，它們的條(tiao)帶(dai)也要(yao)符(fu)合(he)方(fang)法2中(zhong)的條(tiao)件(jian)），則說明(ming)RNA溶液中(zhong)沒有(you)殘留(liu)的RNA酶(mei)汙(wu)染(ran)，RNA的質量(liang)很(hen)好。相(xiang)反(fan)的(de)，如(ru)果70℃保(bao)溫(wen)的(de)樣(yang)本有(you)明(ming)顯的降(jiang)解，則(ze)說明(ming)RNA溶液中(zhong)有(you)RNA酶(mei)汙(wu)染(ran)。

如(ru)果妳(ni)的(de)RNA樣(yang)本通過了(le)保(bao)溫(wen)實(shi)驗(yan)的(de)檢(jian)測(ce)並(bing)且妳在(zai)後(hou)續(xu)的(de)實(shi)驗(yan)中(zhong)還是非(fei)常(chang)小(xiao)心的防範RNA酶(mei)的(de)騷擾，那麽妳的(de)實(shi)驗(yan)應(ying)該(gai)是很(hen)難失(shi)敗了！