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LBA4404 感受(shou)態細(xi)胞100ul*10菌株壹(yi)種常(chang)用於質(zhi)粒(li)克隆的(de)菌株。其(qi)φ80lacZΔM15基因(yin)的(de)產物可與(yu)pUC載(zai)體編(bian)碼(ma)的(de)b-半(ban)乳糖(tang)苷(gan)酶氨(an)基端實(shi)現a互(hu)補,可用於藍(lan)白(bai)斑(ban)篩選。recA1和(he)endA1 的(de)突變有利於克隆DNA 的(de)穩定和高純(chun)度(du)質(zhi)粒(li)DNA的(de)提取(qu)。
LBA4404 感受(shou)態細(xi)胞100ul*10操作方法(fa)(以下(xia)操作均(jun)按無(wu)菌條件的(de)標準進(jin)行(xing))
1 取(qu)感受(shou)態細(xi)胞置於冰(bing)浴(yu)中,如(ru)需分(fen)裝(zhuang)可(ke)將(jiang)剛(gang)融化細胞懸液(ye)分裝(zhuang)到(dao)無(wu)菌預冷(leng)的(de)離(li)心(xin)管(guan)中,置於冰(bing)浴(yu)中。
● 壹次轉(zhuan)化感受(shou)態細(xi)胞的(de)建(jian)議(yi)用量為50-100 μl,可(ke)以(yi)根據(ju)實(shi)際(ji)情(qing)況(kuang)分(fen)裝(zhuang)使(shi)用。應(ying)註意(yi)所(suo)用DNA 體(ti)積(ji)不要超過(guo)感受(shou)態細(xi)胞懸液(ye)體積(ji)的(de)十分之(zhi)壹(yi)。
以(yi)下(xia)實(shi)驗(yan)以(yi)100 μl感受(shou)態細(xi)胞為例(li)。
2 向(xiang)感受(shou)態細(xi)胞懸液(ye)中加(jia)入目(mu)的(de)DNA(100 μl 的(de)感受(shou)態細(xi)胞能夠(gou)被1 ng 超螺(luo)旋質(zhi)粒DNA 所飽(bao)和(he)),輕(qing)輕(qing)旋(xuan)轉離(li)心(xin)管(guan)以混勻內(nei)容(rong)物,在冰(bing)浴(yu)中靜置30 分(fen)鐘。
LBA4404 感受(shou)態細(xi)胞100ul*103 將(jiang)離(li)心(xin)管(guan)置於42℃水(shui)浴(yu)中放置60-90 秒,然(ran)後(hou)快(kuai)速(su)將(jiang)管(guan)轉移(yi)到(dao)冰(bing)浴(yu)中,使(shi)細(xi)胞(bao)冷(leng)卻(que)2-3 分鐘,該(gai)過(guo)程(cheng)不要搖動(dong)離(li)心(xin)管(guan)。
4 向每(mei)個離(li)心(xin)管(guan)中加(jia)入(ru)900 μl 無(wu)菌的(de)SOC 或LB 培養(yang)基(不含(han)抗生素(su)), 混勻後(hou)置於37℃搖床振蕩培養(yang)1 小時(160-220 轉/分(fen)鐘),目(mu)的(de)是使(shi)質(zhi)粒(li)上(shang)相關的(de)抗性標記基因(yin)表達,使(shi)菌體復蘇。
5 將(jiang)離(li)心(xin)管(guan)內(nei)容(rong)物混勻,吸取(qu)100 μl 已(yi)轉(zhuan)化(hua)的(de)感受(shou)態細(xi)胞加到(dao)含(han)相應抗生素(su)的(de)SOB 或LB 固體(ti)瓊(qiong)脂培養(yang)基上(shang),用無(wu)菌的(de)彎頭玻(bo)棒輕(qing)輕(qing)的(de)將(jiang)細(xi)胞(bao)均(jun)勻塗開。將(jiang)平(ping)板置於室(shi)溫(wen)直(zhi)至液(ye)體被(bei)吸收(shou),倒(dao)置平(ping)板,37℃培養(yang)12-16 小時。
● 塗布(bu)用量可根據(ju)具(ju)體實(shi)驗(yan)來調整(zheng)。如(ru)轉化(hua)的(de)DNA 總量較(jiao)多(duo),可取(qu)更(geng)少(shao)量轉化(hua)產(chan)物塗布(bu)平板;反之(zhi),如(ru)轉化(hua)的(de)DNA 總量較(jiao)少(shao),可取(qu)200-300 μl 轉(zhuan)化(hua)產(chan)物塗布(bu)平板。如(ru)果預計的(de)克隆較(jiao)少(shao),可通過離(li)心(xin)(4,000 rpm, 2分鐘)後(hou)吸除部分培養(yang)液(ye),懸浮(fu)菌體後(hou)將(jiang)其(qi)塗(tu)布(bu)於壹(yi)個(ge)平(ping)板中。(塗(tu)布(bu)剩余(yu)的(de)菌液(ye)可置於4℃保存(cun),如(ru)果次日(ri)的(de)轉化菌落(luo)數(shu)過少(shao)可以(yi)將(jiang)剩(sheng)下(xia)的(de)菌液(ye)再(zai)塗布(bu)新的(de)培養(yang)板)
LBA4404 感受(shou)態細(xi)胞100ul*10 註意(yi)事(shi)項
1. 感受(shou)態細(xi)胞應保存(cun)在 -70℃,不可(ke)多(duo)次凍融和放置時間過(guo)長,以(yi)避(bi)免降低感受(shou)態細(xi)胞的(de)轉化效率(lv)。
2. 進(jin)行(xing)轉(zhuan)化(hua)操作時,應根據(ju)相應溫度(du)及(ji)無(wu)菌條件的(de)要求(qiu)進(jin)行(xing)。
3 為(wei)防(fang)止(zhi)轉(zhuan)化實驗(yan)不成功(gong),可(ke)以(yi)保留(liu)部分連(lian)接反(fan)應液(ye),以重新轉(zhuan)化(hua),將(jiang)損(sun)失(shi)降到(dao)低。
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