EHA105 電感受態(tai)細胞(bao)50ul*50

EHA105 電(dian)感受態(tai)細胞(bao)50ul*50 操(cao)作方(fang)法(fa)（以下操(cao)作均(jun)按無(wu)菌條(tiao)件(jian)的標準進行(xing)）
1 取(qu)感受態(tai)細胞(bao)置於(yu)冰(bing)浴(yu)中，如(ru)需(xu)分(fen)裝可將(jiang)剛融(rong)化(hua)細胞(bao)懸液(ye)分裝到無(wu)菌預(yu)冷(leng)的(de)離心(xin)管(guan)中(zhong)，置(zhi)於(yu)冰(bing)浴(yu)中。
●  壹(yi)次轉(zhuan)化(hua)感受態(tai)細胞(bao)的建(jian)議(yi)用(yong)量(liang)為(wei)50-100 μl，可以根(gen)據實(shi)際(ji)情況(kuang)分裝使用(yong)。應(ying)註意(yi)所用(yong)DNA 體積不要(yao)超過感受態(tai)細胞(bao)懸液(ye)體積的(de)十(shi)分之(zhi)壹(yi)。
以下實(shi)驗(yan)以100 μl感受態(tai)細胞(bao)為(wei)例。
EHA105 電感受態(tai)細胞(bao)50ul*502 向(xiang)感受態(tai)細胞(bao)懸液(ye)中加(jia)入(ru)目(mu)的DNA（100 μl 的感受態(tai)細胞(bao)能夠(gou)被1 ng 超螺旋質粒DNA 所(suo)飽和(he)），輕(qing)輕(qing)旋轉(zhuan)離心(xin)管(guan)以混(hun)勻內(nei)容物(wu)，在冰(bing)浴(yu)中靜置(zhi)30 分(fen)鐘(zhong)。
3 將(jiang)離心(xin)管(guan)置(zhi)於(yu)42℃水(shui)浴(yu)中放置60-90 秒，然後(hou)快(kuai)速將(jiang)管(guan)轉(zhuan)移(yi)到冰浴(yu)中，使(shi)細(xi)胞(bao)冷卻2-3 分鐘(zhong)，該(gai)過程不要(yao)搖動(dong)離心(xin)管(guan)。
4 向(xiang)每(mei)個(ge)離心(xin)管(guan)中(zhong)加(jia)入(ru)900 μl 無(wu)菌的(de)SOC 或(huo)LB 培養基(ji)（不含抗(kang)生(sheng)素）， 混(hun)勻後(hou)置於(yu)37℃搖(yao)床(chuang)振(zhen)蕩培養1 小時(shi)（160-220 轉(zhuan)/分(fen)鐘(zhong)），目(mu)的是使質粒上(shang)相關(guan)的抗(kang)性(xing)標記(ji)基(ji)因(yin)表達(da)，使菌體復蘇。
EHA105 電感受態(tai)細胞(bao)50ul*505 將(jiang)離心(xin)管(guan)內(nei)容物(wu)混(hun)勻，吸(xi)取(qu)100 μl 已(yi)轉(zhuan)化(hua)的感受態(tai)細胞(bao)加(jia)到含相(xiang)應(ying)抗(kang)生(sheng)素的SOB 或(huo)LB 固體瓊(qiong)脂培養基(ji)上(shang)，用(yong)無(wu)菌的(de)彎(wan)頭(tou)玻棒(bang)輕(qing)輕(qing)的(de)將(jiang)細(xi)胞(bao)均勻(yun)塗開(kai)。將(jiang)平板置(zhi)於(yu)室(shi)溫(wen)直(zhi)至液(ye)體被吸(xi)收，倒置(zhi)平板，37℃培養12-16 小時(shi)。
●  塗布(bu)用(yong)量(liang)可根(gen)據具(ju)體實(shi)驗(yan)來調(tiao)整(zheng)。如轉(zhuan)化(hua)的DNA 總量(liang)較多，可(ke)取(qu)更少量(liang)轉(zhuan)化(hua)產物(wu)塗(tu)布(bu)平板；反(fan)之，如(ru)轉(zhuan)化(hua)的DNA 總量(liang)較少，可取(qu)200-300 μl 轉(zhuan)化(hua)產物(wu)塗(tu)布(bu)平板。如(ru)果預(yu)計(ji)的(de)克(ke)隆(long)較少，可通(tong)過(guo)離心(xin)（4,000 rpm, 2分(fen)鐘(zhong)）後(hou)吸(xi)除部(bu)分(fen)培養液，懸(xuan)浮(fu)菌體後將(jiang)其(qi)塗布(bu)於(yu)壹(yi)個(ge)平板中(zhong)。（塗(tu)布(bu)剩(sheng)余的菌液(ye)可(ke)置(zhi)於(yu)4℃保(bao)存(cun)，如果次日(ri)的轉(zhuan)化(hua)菌落(luo)數(shu)過少可以將(jiang)剩(sheng)下的(de)菌液(ye)再(zai)塗(tu)布(bu)新(xin)的培養板）
 註意(yi)事(shi)項
1. 感受態(tai)細胞(bao)應(ying)保存(cun)在 -70℃，不可多(duo)次凍(dong)融(rong)和放置時間過長，以避免(mian)降低感受態(tai)細胞(bao)的轉(zhuan)化(hua)效率(lv)。
2. 進行(xing)轉(zhuan)化(hua)操(cao)作時(shi)，應(ying)根(gen)據相(xiang)應(ying)溫(wen)度(du)及(ji)無(wu)菌條(tiao)件(jian)的要(yao)求(qiu)進行。
3 為(wei)防止(zhi)轉(zhuan)化(hua)實(shi)驗(yan)不成(cheng)功(gong)，可(ke)以保留(liu)部(bu)分(fen)連接反(fan)應(ying)液，以重新(xin)轉(zhuan)化(hua)，將(jiang)損(sun)失(shi)降到低。
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