組(zu)織(zhi)細(xi)胞(bao)microRNA提取試(shi)劑盒

公(gong)司(si)產品僅(jin)供科研研究(jiu)使(shi)用(yong)、不得用(yong)於臨(lin)床診斷！

商(shang)品屬(shu)性(xing)

產(chan)品介(jie)紹(shao)：

描(miao)述(shu)：生產(chan)的組(zu)織(zhi)細(xi)胞(bao) miRNA 提取試(shi)劑盒是目前世(shi)界(jie) 上提取(qu)小 RNA（<200nt）操作(zuo)步驟重(zhong)復(fu)性、 小 RNA 產(chan)率的方(fang)法。使(shi)用(yong)該試(shi)劑盒提(ti)取(qu)的小(xiao) RNA （Small RNA）中，長度(du)在(zai) 15～200nt 範圍的 RNA 在(zai) 95% 以上，基本(ben)不(bu)含有大(da) RNA 和(he) DNA。使(shi)用(yong)該試(shi)劑通過(guo)壹步上 柱即(ji)可(ke)獲(huo)得高(gao)純度(du) miRNA，可(ke)在(zai) 45min 內完(wan)成(cheng)小(xiao) RNA 的提(ti) 取(qu)。該試(shi)劑盒廣(guang)泛適(shi)用(yong)於動物組(zu)織、細(xi)胞(bao)和多(duo)糖(tang)多(duo)酚(fen)含(han)量(liang)不(bu) 高(gao)的植(zhi)物組(zu)織樣(yang)本(ben)。

儲(chu)存(cun)：室(shi)溫(wen)可(ke)保存(cun) 2 年(nian)。

使(shi)用(yong)防(fang)護(hu)建(jian)議：miRNA Reagent A 溶(rong)液(ye)中含有胍(gua)鹽，其具有 強(qiang)烈(lie)的腐蝕(shi)性(xing)，試(shi)驗(yan)時請務必(bi)佩戴(dai)防(fang)護(hu)眼鏡(jing)、手套(tao)、口(kou)罩等(deng) 防(fang)護(hu)措施(shi)，如有皮(pi)膚(fu)接(jie)觸(chu)請立即(ji)用(yong)大量(liang)清(qing)水沖洗，再(zai)另行就 醫(yi)。

操作(zuo)方法： 1. 組(zu)織(zhi)樣本(ben)提(ti)取 (1) 向 1.5ml EP 管中加入(ru) 300μl miRNA Reagent A。植物組(zu) 織則再(zai)加入(ru) 10μl β-巰基(ji)乙(yi)醇，混(hun)合(he)均勻。 (2) 在(zai)液(ye)氮條件下(xia)充分(fen)將(jiang)組織(zhi)研磨(mo)粉碎，將(jiang)壹定的樣(yang)品量(liang)（見 樣(yang)本(ben)使(shi)用(yong)量(liang)表(biao)）研磨(mo)成粉狀的組(zu)織(zhi)加(jia)入(ru)到上述(shu) 300μl miRNA Reagent A 中，立即(ji)手腕(wan)用(yong)力(li)震(zhen)蕩(dang)至(zhi)組(zu)織(zhi)粉末(mo)溶(rong)解於裂(lie) 解液(ye)中。室(shi)溫(wen)靜(jing)置 5min 以充分(fen)裂(lie)解細(xi)胞(bao)。 註意(yi)：將(jiang)組織(zhi)加入(ru)到 miRNA Reagent A 後(hou)要迅速(su)將(jiang)組(zu)織(zhi)震(zhen)散，否 則易引起(qi)組(zu)織(zhi)成團(tuan)狀，不(bu)容(rong)易(yi)裂解。如發生成(cheng)團(tuan)狀，務移(yi)液(ye)器 將(jiang)團(tuan)狀組(zu)織(zhi)吹(chui)打(da)松(song)散。 (3) 向上述(shu)裂解完(wan)畢(bi)的裂(lie)解液(ye)中加入(ru) 350μl miRNA Reagent B，上下(xia)顛(dian)倒(dao)混(hun)合(he)均勻。13,000rpm 離(li)心 5min，吸(xi)取 550μl 上清液(ye)，轉移到新(xin)的 1.5ml EP 管(guan)中。 (4) 向上述(shu)溶(rong)液(ye)中加入(ru) 200μl 無(wu)水乙醇，手腕(wan)用(yong)力(li)震(zhen)蕩(dang)數(shu)次， 室(shi)溫(wen)放置 5min。 (5) 13,000rpm 離(li)心 10min，轉移 700μl 上清液(ye)到新(xin)的 1.5ml EP 管(guan)中。 (6) 向上述(shu)溶(rong)液(ye)中加入(ru) 300μl 異(yi)丙醇，手腕(wan)用(yong)力(li)上下(xia)顛(dian)倒(dao)數(shu) 次。 (7) 分(fen)兩次將(jiang)上述(shu)溶(rong)液(ye)倒入(ru)到 miRNA 吸附(fu)柱中，13,000rpm 離心(xin) 1min，倒(dao)掉過(guo)濾(lv)液(ye)。 (8) 向吸附柱中加入(ru)700μl 75%異(yi)丙醇洗滌壹次，13,000rpm 離(li)心(xin) 1min，倒(dao)掉(diao)過(guo)濾(lv)液(ye)。 (9) 向吸附柱中加入(ru) 500μl 無(wu)水乙醇洗滌壹次，13,000rpm 離(li)心(xin) 1min，倒(dao)掉(diao)過(guo)濾(lv)液(ye)。 (10) 吸附(fu)柱(zhu) 13,000rpm 空(kong)離心 2min，去掉(diao)殘留(liu)的乙(yi)醇。 (11) 將(jiang)吸(xi)附柱(zhu)放入(ru)到新(xin) 1.5ml EP 管中，室(shi)溫(wen)放置 2min，使(shi) 殘留(liu)乙醇揮(hui)發(fa)。在(zai)吸(xi)附(fu)柱濾(lv)芯上加入(ru) 30μl RnaseFree TE Buffer，室(shi)溫(wen)靜(jing)置 2min，13,000rpm 離心(xin) 2min，洗脫(tuo)產(chan)物 即(ji)為提取(qu)的 miRNA。（通常(chang)取 1～2μl 該產(chan)物，即(ji)可(ke)使用(yong) 壹步法 miRNA 反(fan)轉錄試(shi)劑盒進(jin)行反(fan)轉錄反(fan)應，

2. 細(xi)胞(bao)樣本(ben)提(ti)取 (1) 貼壁細(xi)胞(bao)：消(xiao)化細(xi)胞(bao)後(hou)，離心(xin)收(shou)集(ji)細(xi)胞(bao)沈(chen)澱(dian)。用(yong) 100μl 1×PBS 重懸(xuan)細(xi)胞(bao)後(hou)，加入(ru) 300μl miRNA Reagent A 顛倒(dao)混(hun) 合(he)均勻，室(shi)溫(wen)放置 5min。 (2) 懸(xuan)浮細(xi)胞(bao)：直(zhi)接(jie)離心(xin)後(hou)，收集(ji)細(xi)胞(bao)沈(chen)澱(dian)。用(yong) 100μl 1×PBS 重懸(xuan)細(xi)胞(bao)後(hou)，加入(ru) 300μl miRNA Reagent A 顛倒(dao)混(hun)合(he)均勻， 室(shi)溫(wen)放置 5min。 (3) 向上述(shu)裂解完(wan)畢(bi)的裂(lie)解液(ye)中加入(ru) 250μl miRNA Reagent B，上下(xia)顛(dian)倒(dao)混(hun)合(he)均勻。13,000rpm 離(li)心 5min，吸(xi)取 550μl 上清液(ye)，轉移到新(xin)的 1.5ml EP 管(guan)中。 註意(yi)：加(jia)入(ru)細(xi)胞(bao)體積數(shu)與(yu) miRNA Reagent B 總(zong)體(ti)積(ji)數(shu)為 350μl。如加(jia)入(ru) 50μl細(xi)胞(bao)，則 miRNA Reagent B使用(yong) 300μl。 (4) 向上述(shu) 550μl 上清溶(rong)液(ye)中加入(ru) 200μl 無(wu)水乙醇，手腕(wan)用(yong) 力(li)震(zhen)蕩(dang)數(shu)次，室(shi)溫(wen)放置 5min。 (5) 13,000rpm 離(li)心 10min，轉移 700μl 上清液(ye)到新(xin)的 1.5ml EP 管(guan)中。 (6) 向上述(shu)溶(rong)液(ye)中加入(ru) 300μl 異(yi)丙醇，手腕(wan)用(yong)力(li)上下(xia)顛(dian)倒(dao)數(shu) 次。 (7) 分(fen)兩次將(jiang)上述(shu)溶(rong)液(ye)倒入(ru)到 miRNA 吸附(fu)柱中，13,000rpm 離心(xin) 1min，倒(dao)掉過(guo)濾(lv)液(ye)。 (8) 向吸附柱中加入(ru)700μl 75%異(yi)丙醇洗滌壹次，13,000rpm 離(li)心(xin) 1min，倒(dao)掉(diao)過(guo)濾(lv)液(ye)。 (9) 向吸附柱中加入(ru) 500μl 無(wu)水乙醇洗滌壹次，13,000rpm 離(li)心(xin) 1min，倒(dao)掉(diao)過(guo)濾(lv)液(ye)。 (10) 吸附(fu)柱(zhu) 13,000rpm 空(kong)離心 2min，去掉(diao)殘留(liu)的乙(yi)醇。 (11) 將(jiang)吸(xi)附柱(zhu)放入(ru)到新(xin) 1.5ml EP 管中，室(shi)溫(wen)放置 2min，使(shi) 殘留(liu)乙醇揮(hui)發(fa)。在(zai)吸(xi)附(fu)柱濾(lv)芯上加入(ru) 30μl RnaseFree TE Buffer，室(shi)溫(wen)靜(jing)置 2min，13,000rpm 離心(xin) 2min，洗脫(tuo)產(chan)物 即(ji)為提取(qu)的 miRNA。（通常(chang)取 1～2μl 該產(chan)物，即(ji)可(ke)使用(yong) 壹步法 miRNA 反(fan)轉錄試(shi)劑盒進(jin)行反(fan)轉錄反(fan)應，。

常(chang)見問(wen)題(ti)匯總(zong)： (1) 本(ben)方(fang)法提(ti)取(qu)的小(xiao) RNA，95％以上為小 RNA（200nt 的 RNA，通常(chang)殘留(liu)的>200nt RNA 不(bu)影(ying)響(xiang)後(hou)續(xu)試(shi)驗(yan)操作(zuo)。 (2) 本(ben)試(shi)劑盒提(ti)取(qu)的小(xiao) RNA 由於不(bu)含(han) mRNA 等大(da)分(fen)子(zi)量(liang)的 RNA，因(yin)此(ci)更(geng)適(shi)合(he)做後(hou)續(xu)反轉錄試(shi)驗(yan)，從而進(jin)行定(ding)量(liang)試(shi)驗(yan)。 (3) 使用(yong)本(ben)試(shi)劑盒提(ti)取(qu)的 miRNA 濃(nong)度(du)通常(chang)在(zai) 50ng/μl 左(zuo)右(you)， 取 5～10μl 即(ji)可(ke)用(yong)於電(dian)泳(yong)檢(jian)測。取(qu) 1~2μl 即(ji)可(ke)用(yong)於 HG TaqMan miRNA 反(fan)轉錄試(shi)劑盒進(jin)行反(fan)轉錄反(fan)應

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