PCR反應(ying)體(ti)系(xi)由(you)反(fan)應(ying)緩(huan)沖液（PCR Buffer）、脫氧(yang)核(he)苷(gan)三(san)磷酸底物（dNTP mix）、耐(nai)熱(re)DNA聚合酶(mei)（Taq 酶(mei)）、寡(gua)聚核(he)苷(gan)酸引物（Primer1，Primer2）、靶序列(lie)（DNA模板）五部(bu)分(fen)組成。各個組份(fen)對(dui)PCR結果(guo)至(zhi)關(guan)重要。

1. 反應(ying)緩(huan)沖液：壹(yi)般(ban)隨Taq DNA聚(ju)合酶(mei)試劑(ji)盒(he)供應(ying)。

標(biao)準緩沖液含(han)：50mM KCl，10mM Tris-HCl（pH8.3，室溫(wen)），1.5mM MgCl2。Mg2+的(de)濃(nong)度(du)對(dui)反應(ying)的(de)特異(yi)性及(ji)產量(liang)有著顯(xian)著影(ying)響(xiang)；濃(nong)度(du)過高(gao)，使反(fan)應(ying)特異(yi)性降(jiang)低；濃(nong)度(du)過低，使(shi)產物減(jian)少(shao)。在(zai)各種(zhong)單核(he)苷(gan)酸濃(nong)度(du)為(wei)200 μM時(shi)，Mg2+為(wei)1.5 mM較合適(shi)。若(ruo)樣(yang)品中(zhong)含(han)EDTA或(huo)其(qi)它螯(ao)合物，可適(shi)當(dang)增加(jia)Mg2+的濃(nong)度(du)，在(zai)高(gao)濃(nong)度(du)DNA及dNTP條件下進行(xing)反應(ying)時(shi)，也必須(xu)相應(ying)調(tiao)節(jie)Mg2+的(de)濃(nong)度(du)。據經驗，壹(yi)般(ban)以(yi)1.5-2mM（終濃(nong)度(du)）較好(hao)（僅(jin)供參(can)考(kao)）。

2. dNTP ：高(gao)濃(nong)度(du)dNTP易產生(sheng)錯誤(wu)摻入，過(guo)高(gao)則可能不擴增；但(dan)濃(nong)度(du)過低，將降(jiang)低反(fan)應(ying)產物的產量(liang)。PCR中常(chang)用終濃(nong)度(du)為(wei)50-400 μM的(de)dNTP。四(si)種(zhong)脫氧(yang)三(san)磷酸核苷(gan)酸的濃(nong)度(du)應(ying)相(xiang)同(tong)，如(ru)果(guo)其(qi)中任(ren)何(he)壹(yi)種的濃(nong)度(du)明(ming)顯(xian)不同(tong)於(yu) 其(qi)它幾(ji)種時（偏(pian)高(gao)或偏(pian)低），就(jiu)會(hui)誘(you)發(fa)聚(ju)合酶(mei)的錯誤(wu)摻入作(zuo)用(yong)，降(jiang)低合成速度，過(guo)早(zao)終止延(yan)伸反(fan)應(ying)。此外，dNTP能與Mg2+結(jie)合，使(shi)遊(you)離的Mg2+濃(nong)度(du)降(jiang)低。因(yin)此，dNTP的濃(nong)度(du)直(zhi)接影(ying)響(xiang)到(dao)反(fan)應(ying)中(zhong)起重要作用(yong)的(de)Mg2+濃(nong)度(du)。

3. Taq DNA聚合酶(mei)：在(zai)100μL反(fan)應(ying)體(ti)系(xi)中(zhong)，壹(yi)般(ban)加(jia)入2-4U的(de)酶(mei)量，足以(yi)達到(dao)每min延(yan)伸1000-4000個核苷(gan)酸的摻(chan)入(ru)速度。酶(mei)量過(guo)多(duo)將導(dao)致(zhi)產生(sheng)非特異(yi)性產物。但(dan)是，不同(tong)的(de)公(gong)司或(huo)不同(tong)批(pi)次(ci)的(de)產品(pin)常有很大的(de)差異(yi)，由於(yu)酶(mei)的濃(nong)度(du)對(dui) PCR 反應(ying)影(ying)響(xiang)極大，因(yin)此應(ying)當(dang)作預試(shi)驗或(huo)使用廠(chang)家推(tui)薦的濃(nong)度(du)。當降(jiang)低反(fan)應(ying)體(ti)積時(shi)（如(ru)20μL或(huo) 50 μL），壹(yi)般(ban)酶(mei)的用(yong)量(liang)仍不小(xiao)於(yu)2U，否則反應(ying)效(xiao)率(lv)將降(jiang)低。

4. 引物：引物是擴(kuo)增PCR結果(guo)的(de)關(guan)鍵(jian)，引物設計(ji)在(zai)PCR反(fan)應(ying)中(zhong)極為(wei)重要。要保證PCR反(fan)應(ying)能準(zhun)確(que)、特異(yi)、有效地(di)對(dui)模板DNA進行(xing)擴增，通(tong)常引物設計(ji)要遵(zun)循以(yi)下幾(ji)條原則：

（1）引物的長度以(yi)15-30 bp為(wei)宜，通(tong)常設計(ji)長度為(wei)17-25bp；GC含(han)量(liang)在(zai)40-60%（最(zui)好(hao)在(zai)45-55%）；兩條引物的Tm值(zhi)應(ying)盡量(liang)接近，可(ke)以(yi)采用(yong)專用(yong)軟(ruan)件來計(ji)算（Primer Premier 5）；盡量(liang)避(bi)免A/G或T/C的連續(xu)排列(lie)，局部避(bi)免GC rich或AT rich（特別是3’端），堿(jian)基的(de)分(fen)布(bu)應(ying)表(biao)現(xian)出是隨(sui)機(ji)的。

（2）互補性(xing)，引物內部或(huo)兩條引物之間(jian)避(bi)免3個堿基(ji)以(yi)上(shang)的(de)互補序(xu)列(lie)，引物末端避(bi)免2base以(yi)上(shang)的(de)互補序(xu)列(lie)。引物的3’端不應(ying)與引物內部有互補，避(bi)免引物內部形(xing)成二級結(jie)構(gou)，兩個引物在(zai)3’端不應(ying)出現(xian)同(tong)源(yuan)性(xing)，以(yi)免形成引物二聚體(ti)。3’端末(mo)位堿(jian)基(ji)（最(zui)好(hao)是G或(huo)C，避(bi)免為(wei)T）在(zai)很(hen)大程(cheng)度上(shang)影(ying)響(xiang)著Taq酶(mei)的延(yan)伸效(xiao)率(lv)。

（3）引物濃(nong)度(du)不宜偏(pian)高(gao)，濃(nong)度(du)過高(gao)有兩個弊端：壹(yi)是容(rong)易(yi)形(xing)成引物二聚體(ti)（primer-dimer），二是當(dang)擴(kuo)增微(wei)量(liang)靶序列(lie)並且起始材料又(you)比(bi)較粗(cu)時，容(rong)易(yi)產生(sheng)非特異(yi)性產物。壹般(ban)說(shuo)來，用低濃(nong)度(du)引物不僅經(jing)濟(ji)，而且反應(ying)特異(yi)性也(ye)較好(hao)。壹(yi)般(ban)用0.25-0.5pM/μL較好(hao)。

（4）引物壹般(ban)用TE配(pei)制(zhi)成較高(gao)濃(nong)度(du)的母液（約(yue)100 μM），保存(cun)於-20 ℃。使(shi)用前(qian)取(qu)出其(qi)中壹(yi)部(bu)分(fen)用ddH2O配制(zhi)成10 μM或20 μM的(de)工作(zuo)液。

5．模板：PCR對(dui)模板的要求不高(gao)，單、雙(shuang)鏈DNA均(jun)可作(zuo)為(wei)PCR模板。雖然 PCR 可以(yi)微(wei)量(liang)的樣(yang)品（甚至(zhi)是來(lai)自(zi)單壹(yi)細(xi)胞(bao)的(de)DNA）作為(wei)模板，但(dan)為(wei)了保證反(fan)應(ying)的(de)特異(yi)性，壹(yi)般(ban)還(hai)宜用(yong)μg水(shui)平的(de)基(ji)因組DNA或 拷(kao)貝(bei)數(shu)較高(gao)的待(dai)擴增片段(duan)作(zuo)為(wei)起(qi)始模板。原材料可以(yi)是粗(cu)制品(pin)，某些(xie)材料甚至(zhi)僅(jin)需(xu)用溶(rong)劑壹(yi)步提取(qu)之後(hou)即可用(yong)於(yu)擴增，但(dan)混(hun)有任何(he)蛋白酶(mei)、核酸酶(mei)、Taq DNA 聚合酶(mei)抑制(zhi)劑(ji)以(yi)及(ji)能結(jie)合 DNA 的(de)蛋(dan)白，將可(ke)能幹(gan)擾PCR反應(ying)。

6. PCR循(xun)環加(jia)快，即(ji)相(xiang)對(dui)減(jian)少(shao)變(bian)性、復性、延(yan)伸的(de)時(shi)間，可增加(jia)產物的特異(yi)性。

四(si)、註意(yi)事項(xiang)：

1.PCR應(ying)該在(zai)沒有DNA汙(wu)染的(de)幹(gan)凈(jing)環境中進行(xing)，最(zui)好(hao)設(she)立(li)壹(yi)個專用(yong)的(de)PCR配制(zhi)室、模板室、擴(kuo)增室，避(bi)免汙(wu)染（16S）。

2.純(chun)化(hua)模板所(suo)選用的方法對(dui)汙(wu)染的(de)風(feng)險(xian)有極大影(ying)響(xiang)。壹般(ban)而言，只要能夠(gou)得到(dao)可(ke)靠的結(jie)果(guo)，純(chun)化(hua)的(de)方(fang)法越簡單越(yue)好(hao)。

3.所(suo)有試劑(ji)都(dou)應(ying)該沒有核酸和核酸酶(mei)的汙(wu)染，操(cao)作(zuo)過(guo)程(cheng)中均(jun)應(ying)戴手(shou)套。

4.PCR試劑(ji)配(pei)制(zhi)應(ying)使(shi)用最(zui)高(gao)質量(liang)的(de)新(xin)鮮(xian)雙(shuang)蒸水，采用(yong)0.22μm濾膜過濾(lv)除(chu)菌或(huo)高(gao)溫(wen)高(gao)壓滅(mie)菌(jun)。

5.試劑都(dou)應(ying)該以(yi)大體(ti)積配(pei)制(zhi)，然後(hou)分裝成僅夠(gou)壹次(ci)使(shi)用的量儲存(cun)，從而確(que)保實(shi)驗與實(shi)驗之(zhi)間的連續(xu)性與平(ping)行(xing)性(xing)。

6.試劑或樣(yang)品準(zhun)備(bei)過(guo)程(cheng)中都(dou)要使用(yong)滅(mie)菌(jun)的tubes和tips，玻璃器皿(min)應(ying)洗(xi)滌幹(gan)凈(jing)並高(gao)壓滅(mie)菌(jun)。

7.PCR配制試劑(ji)應(ying)在(zai)冰(bing)上(shang)融(rong)化(hua)，並且要瞬離(li)並充(chong)分混(hun)勻(yun)。