NovaBlue（DE3） 感(gan)受態細(xi)胞100ul*50

NovaBlue(DE3) 感(gan)受態細(xi)胞100ul*50 操作(zuo)方(fang)法(fa)（以(yi)下操(cao)作(zuo)均(jun)按無菌(jun)條(tiao)件的(de)標準進行）
1 取感(gan)受態細(xi)胞置於冰(bing)浴(yu)中，如需(xu)分(fen)裝(zhuang)可將剛(gang)融(rong)化(hua)細胞懸液分(fen)裝(zhuang)到無菌(jun)預(yu)冷的(de)離心管中，置於冰(bing)浴(yu)中。
●  壹次(ci)轉化(hua)感(gan)受態細(xi)胞的(de)建(jian)議(yi)用量(liang)為(wei)50-100 μl，可以根據(ju)實際情況分(fen)裝(zhuang)使用(yong)。應(ying)註意所用(yong)DNA 體積(ji)不(bu)要(yao)超(chao)過感(gan)受態細(xi)胞懸液體積(ji)的(de)十(shi)分(fen)之(zhi)壹。
以下實(shi)驗(yan)以(yi)100 μl感(gan)受態細(xi)胞為(wei)例(li)。
NovaBlue(DE3) 感(gan)受態細(xi)胞100ul*502 向感(gan)受態細(xi)胞懸液中加入目(mu)的(de)DNA（100 μl 的(de)感(gan)受態細(xi)胞能夠被(bei)1 ng 超(chao)螺(luo)旋(xuan)質粒(li)DNA 所(suo)飽(bao)和），輕輕旋轉離(li)心(xin)管以(yi)混勻(yun)內(nei)容物(wu)，在(zai)冰(bing)浴(yu)中靜置30 分(fen)鐘(zhong)。
3 將離心管置(zhi)於42℃水浴(yu)中放(fang)置(zhi)60-90 秒(miao)，然後(hou)快速(su)將管轉移到冰(bing)浴(yu)中，使細(xi)胞冷卻(que)2-3 分(fen)鐘(zhong)，該(gai)過程(cheng)不(bu)要(yao)搖(yao)動離心(xin)管(guan)。
4 向每個離心管中加入900 μl 無菌(jun)的(de)SOC 或LB 培(pei)養基（不(bu)含(han)抗(kang)生(sheng)素(su)）， 混勻(yun)後(hou)置(zhi)於37℃搖(yao)床振蕩(dang)培(pei)養1 小(xiao)時（160-220 轉/分(fen)鐘(zhong)），目的(de)是使質粒(li)上(shang)相(xiang)關(guan)的(de)抗性標記基因表達，使(shi)菌(jun)體復(fu)蘇(su)。
NovaBlue(DE3) 感(gan)受態細(xi)胞100ul*505 將離心管內(nei)容物(wu)混(hun)勻(yun)，吸取(qu)100 μl 已(yi)轉化(hua)的(de)感(gan)受態細(xi)胞加到含(han)相(xiang)應(ying)抗生素(su)的(de)SOB 或LB 固(gu)體瓊脂培(pei)養基上，用無菌(jun)的(de)彎頭玻(bo)棒(bang)輕輕的(de)將細胞均(jun)勻(yun)塗(tu)開(kai)。將平板置於室溫(wen)直至液體被(bei)吸收(shou)，倒(dao)置平(ping)板，37℃培(pei)養12-16 小(xiao)時。
●  塗(tu)布用量(liang)可根據(ju)具體實驗(yan)來調(tiao)整。如(ru)轉化(hua)的(de)DNA 總(zong)量(liang)較(jiao)多，可取更(geng)少量(liang)轉化(hua)產(chan)物(wu)塗(tu)布(bu)平(ping)板；反之，如(ru)轉化(hua)的(de)DNA 總(zong)量(liang)較(jiao)少，可取200-300 μl 轉化(hua)產(chan)物(wu)塗(tu)布(bu)平(ping)板。如果(guo)預計的(de)克隆較(jiao)少，可通過離(li)心（4,000 rpm, 2分(fen)鐘(zhong)）後吸除(chu)部分(fen)培(pei)養液，懸浮菌體後將其塗布於壹個平板中。（塗布(bu)剩余(yu)的(de)菌液可置於4℃保存(cun)，如(ru)果(guo)次日的(de)轉化(hua)菌落(luo)數(shu)過少可以將剩下的(de)菌液再塗布(bu)新的(de)培(pei)養板(ban)）
 註意事項(xiang)
1. 感(gan)受態細(xi)胞應保存(cun)在(zai) -70℃，不(bu)可多次凍融(rong)和放(fang)置(zhi)時間(jian)過長(chang)，以避免(mian)降低(di)感(gan)受態細(xi)胞的(de)轉化(hua)效率(lv)。
2. 進(jin)行轉化(hua)操作(zuo)時，應(ying)根據(ju)相應(ying)溫(wen)度及無菌(jun)條(tiao)件的(de)要求進(jin)行。
3 為(wei)防(fang)止轉化(hua)實驗(yan)不(bu)成(cheng)功(gong)，可以保留(liu)部(bu)分(fen)連(lian)接(jie)反應(ying)液，以重新(xin)轉化(hua)，將損失降到低(di)。
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