Ribonuclease R(Rnase R) 核(he)酸外(wai)切(qie)酶(mei)

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商(shang)品(pin)屬性

產品介(jie)紹(shao)：

RNase R 來(lai)源於(yu) E.coli，通(tong)過基(ji)因工(gong)程重(zhong)組(zu)表(biao)達，該酶(mei)為(wei) Mg2+依(yi)賴的 3’-5’核(he)糖(tang)核(he)酸外(wai)切(qie)酶(mei)。其(qi)可(ke)消(xiao)化所(suo)有(you)線(xian)性(xing) RNAs 底(di)物(wu)，但不(bu)能消(xiao)化環(huan)狀(zhuang) RNA(circular RNA)、套(tao)索 RNA(lariat RNA)、雙(shuang)鏈 RNA、3’突出端<7nt 的(de)雙(shuang)鏈RNA。本酶(mei)可(ke)高效的(de)去除(chu)不(bu)含(han)二級(ji)結(jie)構(gou)的線(xian)性 RNA，從而純(chun)化獲得環 RNA 分子(zi)，用(yong)於(yu)後(hou)續 RNA-sequencing 等實驗(yan)。

活(huo)性定(ding)義(yi)：在(zai) 20 mM Tris-HCl(pH7.5)，100 mM KCl，0.5mM Mg2+條件(jian)下, 37°C 下水(shui)解(jie) 1 μg 的(de) poly-r(A)產物(wu)，所需(xu)酶(mei)量(liang)為 1 個(ge)活(huo)性單(dan)位。10xRNase R Buffer：200 mM Tris-HCl, 1 M KCl，5 mM
MgCl2，pH7.5
酶(mei)儲存液：20 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 1 mM DTT ,50% Glycerol, 0.1% (w/v) Tween-20, pH 7.5。
儲存：置(zhi)於(yu)-20°C 可(ke)保(bao)存 3 年(nian)，避(bi)免反(fan)復(fu)凍(dong)融(rong)。
使(shi)用(yong)方法(fa)
1. 配制反(fan)應體系(xi)
RNA 1-10 μg
10xRNase R Buffer 2.5 μl
Rnase Inhibitor (40 U/μl) 0.5 μl
RNase R (20 U/μl) 1-2 μl
DEPC-treated Water up to 25 μl
2. 37℃孵育(yu) 30-60min，反應完畢(bi)後可(ke)加(jia)入(ru) 5 mM EDTA終(zhong)止反應。
使(shi)用(yong)註(zhu)意(yi)事(shi)項(xiang)：
(1) 在(zai) total RNA 的消(xiao)化中(zhong)，由於(yu)含(han)有(you)二(er)級(ji)結(jie)構(gou)較(jiao)多的RNA，如 tRNA、rRNA、dsRNA 等，RNase R 對(dui)該類底(di)物(wu)消(xiao)化活(huo)性大幅下降，此(ci)時(shi)需要(yao)延(yan)長消(xiao)化時(shi)間至 2h，並(bing)在(zai) 1h 時(shi)補加(jia) RNase R 進(jin)行(xing)消(xiao)化。必(bi)要(yao)時(shi)將反應溫度(du)提高至 45℃，以打(da)開(kai)含(han)有(you)二(er)級(ji)結(jie)構(gou)的 RNA 分(fen)子(zi)。
(2) 對(dui)於(yu)含(han)有(you) highly structured 的(de) RNAs，RNase R 仍然(ran)無(wu)法(fa)消(xiao)化， 稍(shao)後(hou)將推(tui)出 5’-3’的核糖(tang)核(he)酸外(wai)切(qie)酶(mei)以解(jie)決此(ci)類問(wen)題。
(3) 據(ju)其(qi)它(ta)文獻(xian)報道(dao)，在(zai)含(han)有(you) highly structured 的(de) RNAs，可(ke)放大反應體積(ji)至 50 μl，可(ke)降(jiang)低(di)二(er)級(ji)結(jie)構(gou)的影(ying)響(xiang)，從(cong)而促(cu)進(jin) RNA 的(de)降解(jie)。
(4) 高溫和長時(shi)間的(de)孵育(yu)，可(ke)能導(dao)致(zhi) RNA 的(de)非(fei)酶(mei)性(xing)斷裂(lie)（水(shui)分(fen)子(zi)的(de) H+對(dui)二(er)酯(zhi)鍵(jian)的(de)攻擊）。因此(ci)，消(xiao)化時(shi)間、反(fan)應溫度(du)均(jun)需(xu)要(yao)根(gen)據(ju)特(te)定的(de)實驗(yan)進(jin)行(xing)優化和調整(zheng)。

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