測(ce)序(xu)發(fa)現引物(wu)區(qu)有(you)突變，主(zhu)要(yao)考慮三個方(fang)面(mian)的原(yuan)因(yin)：測(ce)序(xu)，PCR/克隆(long)過程，引物(wu)本(ben)身(shen)。

1、測(ce)序(xu)引入(ru)的錯(cuo)誤(wu)

對(dui)於(yu)PCR產(chan)物進(jin)行(xing)的(de)克隆(long)而(er)言(yan)，無(wu)論是(shi)TA克隆(long)或酶(mei)切克隆(long)，引物(wu)區(qu)往(wang)往(wang)位(wei)於(yu)載(zai)體兩(liang)端，如(ru)果(guo)用(yong)載(zai)體(ti)引物(wu)進行(xing)測(ce)序(xu)，此(ci)時(shi)克隆(long)引物(wu)區(qu)離(li)測(ce)序(xu)引物(wu)區(qu)的(de)距離(li)比較(jiao)近，處(chu)於(yu)測(ce)序(xu)起(qi)始(shi)階(jie)段或(huo)正好(hao)處於(yu)測(ce)序(xu)染料(liao)峰(feng)所(suo)在(zai)的(de)區(qu)域(yu)內（90-120 bp），這(zhe)兩(liang)個(ge)區(qu)域(yu)也(ye)是(shi)最容易(yi)產(chan)生測(ce)序(xu)錯誤(wu)的地方(fang)。因(yin)此(ci)，首先要(yao)看原(yuan)始(shi)的(de)測(ce)序(xu)峰(feng)圖在引物(wu)區(qu)內是否(fou)清(qing)晰，堿基(ji)的(de)錯誤(wu)或缺(que)失是否是由(you)於(yu)峰(feng)圖不清(qing)楚(chu)而(er)導(dao)致的(de)計算(suan)機(ji)誤(wu)讀。

2、PCR/克隆(long)過程

盡(jin)管(guan)使用高保(bao)真(zhen)聚合酶(mei)進(jin)行(xing)PCR出錯(cuo)的(de)可能(neng)性(xing)比(bi)較(jiao)少，但(dan)不排除(chu)PCR錯(cuo)配(pei)或者(zhe)克隆(long)過程中(zhong)突變的(de)可能(neng)。有(you)的人(ren)會問，PCR的(de)突變怎(zen)麽(me)會出現(xian)在(zai)引物(wu)區(qu)呢(ne)？這(zhe)是因(yin)為(wei)，引物(wu)是單(dan)鏈(lian)，PCR產(chan)物引物(wu)區(qu)的(de)互(hu)補鏈(lian)同(tong)樣(yang)是(shi)以(yi)引物(wu)為(wei)模(mo)板(ban)進(jin)行(xing)擴增(zeng)得到的，因(yin)此(ci)，有(you)可能(neng)存(cun)在引物(wu)正確但(dan)其產(chan)物出錯(cuo)的(de)情況。

針對這(zhe)種(zhong)情況的(de)解決(jue)方(fang)法是進行測(ce)序(xu)時，請送2-3個(ge)獨立的(de)克隆(long)子(zi)進(jin)行(xing)測(ce)序(xu)，這(zhe)樣可以(yi)排除(chu)PCR過程出錯(cuo)或(huo)克隆(long)產(chan)生突變的(de)情況。

3、引物(wu)本(ben)身(shen)錯誤(wu)

如(ru)前(qian)面(mian)所(suo)述(shu)，引物(wu)合成(cheng)是(shi)壹(yi)種(zhong)多步驟(zhou)的(de)化學反(fan)應(ying)，即(ji)使每(mei)壹步合(he)成(cheng)效(xiao)率(lv)達到99%，仍有(you)1%的(de)序(xu)列(lie)不能連接(jie)或(huo)錯(cuo)誤(wu)地連接(jie)下(xia)壹個(ge)堿基(ji)，這(zhe)些序(xu)列(lie)在(zai)經(jing)過Capping後(hou)脫離(li)循環(huan)，成為(wei)缺(que)堿基(ji)的(de)失敗序列；

對(dui)於(yu)缺(que)失突變，壹(yi)般認(ren)為(wei)是(shi)壹般認為(wei)是(shi)帶帽(capping)反(fan)應(ying)不*造(zao)成(cheng)的，Caping反(fan)應(ying)主要(yao)是封閉極少(shao)數(shu)5'-羥(qiang)基(ji)沒有(you)參加反應(ying)單體(ti)。被(bei)封閉的引物(wu)，在下(xia)壹輪(lun)偶連時(shi)將(jiang)不能繼(ji)續(xu)參與(yu)合成。對於實(shi)驗(yan)中(zhong)測(ce)序(xu)發(fa)現的(de)較(jiao)常見(jian)堿基(ji)缺(que)失的可能(neng)原(yuan)因(yin)如(ru)下(xia)：

1)、 由(you)於(yu)DNA合(he)成(cheng)是(shi)沿著3'→5'端方(fang)向(xiang)將(jiang)堿基(ji)逐(zhu)個連接(jie)上去的，每(mei)連上壹(yi) 個(ge)堿基(ji)，都(dou)需要(yao)經(jing)過 (Detritylation、Coupling、Capping、Oxidation)壹(yi)個(ge)循(xun)環(huan)。Coupling是(shi)上壹(yi)個(ge)堿基(ji)的(de)5'-OH 與(yu)下(xia)壹個(ge)堿基(ji)的(de)3'活(huo)性(xing)部(bu)分(fen)發(fa)生反應(ying)，該(gai)反(fan)應(ying)的效(xiao)率(lv)可達99%，即(ji)便(bian)如(ru)此(ci)，仍有(you)1%的(de)序(xu)列(lie)不能連接(jie)下(xia)壹個(ge)堿基(ji)，這(zhe)些序(xu)列(lie)在(zai)經(jing)過Capping後(hou)脫離(li)循環(huan)，成為(wei)缺(que)堿基(ji)的(de)失敗序列；

2）、 Capping是(shi)將(jiang)沒有(you)連接(jie)上下(xia)壹個(ge)堿基(ji)的(de)5'-OH乙(yi)酰(xian)化，Capping的(de)效(xiao)率(lv)不可能(neng)達到100%，沒有(you)被乙(yi)酰(xian)化的(de)5'OH會進壹步發(fa)生反應(ying)，造(zao)成(cheng)中間(jian)缺堿基(ji)的(de)失敗序列；

3）、 Detritylation是(shi)脫掉上壹(yi)個(ge)堿基(ji)5'-OH上的(de)保(bao)護(hu)基，準(zhun)備(bei)連接(jie)下(xia)壹個(ge)新(xin)堿基(ji)，Detritylation的(de)效(xiao)率(lv)也(ye)不可能(neng)達到100%，沒有(you)脫保(bao)護(hu)的5'-OH會跳過該(gai)循(xun)環(huan)而(er)直(zhi)接(jie)進入下(xia)壹個(ge)循(xun)環(huan)，造(zao)成(cheng)中間(jian)缺堿基(ji)的(de)失敗序列；

至(zhi)於(yu)插(cha)入突變，引物(wu)序列(lie)中(zhong)往(wang)往(wang)是(shi)堿基(ji)重(zhong)復，壹般認為(wei)，偶連過程中(zhong)，正在偶連的(de)部(bu)分(fen)堿基(ji)發(fa)生丟(diu)失DMT，處(chu)於(yu)活(huo)性(xing)狀態(tai)的新(xin)堿基(ji)在(zai)沒有(you)與(yu)上壹(yi)個(ge)堿基(ji)反(fan)應(ying)前(qian)發(fa)生自連，將(jiang)會造(zao)成(cheng)堿基(ji)重(zhong)復，故會發(fa)生插(cha)入同壹(yi)堿基(ji)的(de)突變的(de)失敗序列。

對(dui)於(yu)堿基(ji)置換(huan)的(de)突變，產(chan)生的原(yuan)因(yin)壹(yi)般(ban)認(ren)為(wei)是(shi)堿基(ji)不能100%脫保(bao)護(hu)，即(ji)引物(wu)上可能(neng)含(han)有(you)殘(can)留保(bao)護(hu)基團，通(tong)常(chang)發(fa)生在G轉(zhuan)換(huan)成(cheng)其它(ta)堿基(ji)。堿基(ji)G在(zai)壹(yi)定(ding)條(tiao)件下(xia)可以(yi)轉化為(wei)烯(xi)醇(chun)異(yi)構(gou)體(ti)2,6-diaminopurine（脫嘌呤(ling)），DNA復(fu)制(zhi)和(he)PCR過程中(zhong)DNA聚(ju)合(he)酶(mei)將(jiang)2,6-diaminopurine看(kan)作堿基(ji)A，發(fa)生G到A的(de)轉(zhuan)換(huan)，測(ce)序(xu)就會發(fa)現堿基(ji)G-A置換(huan)。脫嘌呤(ling)現(xian)象在(zai)富(fu)含(han)嘌呤(ling)的(de)引物(wu)中發(fa)生的頻率(lv)較(jiao)高。

引物(wu)合成(cheng)過程中(zhong)，造(zao)成(cheng)堿基(ji)缺(que)失，插(cha)入，置換(huan)突變的(de)因(yin)素(su)客(ke)觀存(cun)在，上述(shu)各(ge)種(zhong)原(yuan)因(yin)產(chan)生的失敗序列可通(tong)過純化不同程度(du)地得到去除(chu)。但是基(ji)於(yu)目(mu)前(qian)大規模生產(chan)的純化方(fang)法，還不能達到100%的(de)純度(du)，對(dui)40 mer以(yi)下(xia)的DNA制(zhi)品(pin)，HPLC是(shi)好(hao)的純化方(fang)法，其次(ci)是(shi)ULTRA PAGE；而(er)對(dui)40 mer以(yi)上的(de)DNA制(zhi)品(pin)ULTRAPAGE純化要(yao)優(you)於(yu)單純的HPLC純化。所(suo)以(yi)，如(ru)您(nin)要(yao)對PCR產(chan)物克隆(long)後(hou)測(ce)序(xu)，壹定(ding)要(yao)選擇(ze)ULTRA PAGE純化或(huo)HPLC純化的(de)引物(wu)。

測(ce)序(xu)發(fa)現引物(wu)區(qu)域(yu)有(you)突變，特(te)別(bie)是40個(ge)堿基(ji)以(yi)下(xia)的引物(wu), 發(fa)生的概(gai)率(lv)不大，但是(shi)偶爾也(ye)會發(fa)生。客(ke)戶壹般可以(yi)放(fang)心(xin)，引物(wu)序列(lie)壹(yi)般(ban)都是通(tong)過電腦直接將(jiang)您(nin)的序(xu)列復制(zhi)到合成(cheng)儀(yi)的(de)，人(ren)為(wei)造(zao)成(cheng)的序(xu)列(lie)出錯(cuo)可能(neng)微(wei)乎(hu)其微(wei)。在(zai)目(mu)前(qian)的技(ji)術(shu)水平下(xia)，各(ge)家(jia)公(gong)司還(hai)沒有(you)辦法*解決(jue)引物(wu)合成(cheng)出錯(cuo)的(de)這(zhe)個問(wen)題(ti)。引物(wu)合成(cheng)的(de)固(gu)相合成原(yuan)理(li)都(dou)壹樣，采用的(de)機(ji)器(qi)也(ye)基(ji)本(ben)相同(tong)，合成主要(yao)原(yuan)料(liao)都是由(you)可數(shu)的(de)幾家跨(kua)國公(gong)司提(ti)供(gong)的，所(suo)以(yi)每(mei)個合成服務商(shang)遇到的問(wen)題(ti)也(ye)基(ji)本(ben)類似，沒有(you)哪家(jia)公(gong)司可以(yi)*避(bi)免。