RNA核(he)酸(suan)提(ti)取及純(chun)化試(shi)劑(ji)盒

特(te)點優(you)勢：

    1.特(te)異(yi)性(xing)：所有(you)產(chan)品使(shi)用(yong)的引(yin)物(wu)均(jun)經(jing)過(guo)詳(xiang)盡的生(sheng)物(wu)信息(xi)學(xue)分析，經(jing)過(guo)GenBank及自(zi)建(jian)龐(pang)大數據(ju)庫(ku)的比對，確保(bao)所用的每(mei)壹(yi)條(tiao)引物均(jun)為(wei)種屬或血(xue)清型特異(yi)的基因序(xu)列區段，可實現對細(xi)菌(jun)種(zhong)屬及血(xue)清型的特(te)異(yi)檢(jian)測(ce)，特(te)異(yi)性(xing)均(jun)達(da)到(dao)佳(jia) 。

    2.   重(zhong)現性(xing)：該系列所有(you)產(chan)品均(jun)經(jing)過(guo)大量實(shi)驗菌(jun)株(zhu)的驗證，重(zhong)現性(xing)為(wei)佳(jia) 。

    3.   靈(ling)敏(min)性(xing)：該系列產(chan)品可實(shi)現對檢測(ce)菌(jun)的高(gao)靈(ling)敏(min)檢測(ce)，當(dang)樣(yang)品中細(xi)菌(jun)的濃度(du)達(da)到103cfu/ml時(shi)，可實(shi)現對其的直(zhi)接(jie)檢測，無(wu)需(xu)繁瑣的增(zeng)菌(jun)過(guo)程。

    4.   實(shi)用性(xing)：檢測(ce)範(fan)圍(wei)廣(guang)，涵蓋(gai)了(le)對人(ren)體危害(hai)較為(wei)嚴(yan)重的17種(zhong)呼吸(xi)道(dao)及腸(chang)道(dao)致(zhi)病菌(jun)，可(ke)實(shi)現對臨床樣(yang)品及其(qi)他(ta)環境取(qu)樣(yang)的快(kuai)速檢測，整個(ge)檢(jian)測(ce)過(guo)程為(wei)3-4個(ge)小時(shi)。

    5.   優(you)勢1：序(xu)列資(zi)源豐富，除GenBank公(gong)布(bu)的序(xu)列(lie)外，公(gong)司(si)還進行了(le)大量菌(jun)株(zhu)的序(xu)列(lie)破譯(yi)，從理論上(shang)保(bao)證所選引(yin)物(wu)具有(you)良(liang)好(hao)的保(bao)守性(xing)和(he)特(te)異(yi)性(xing)。

    6.   優(you)勢2：該系列試(shi)劑(ji)盒均(jun)經(jing)過(guo)大量的保(bao)守性(xing)及特(te)異(yi)性(xing)實驗驗證，憑(ping)借(jie)公(gong)司(si)擁(yong)有(you)的豐富的菌(jun)種(zhong)資(zi)源，每壹(yi)種(zhong)檢測試(shi)劑(ji)盒均(jun)經(jing)過(guo)了(le)20余(yu)種(zhong)標準(zhun)菌(jun)株(zhu)和(he)臨床菌(jun)株(zhu)的保(bao)守性(xing)驗證及40余(yu)種(zhong)近緣(yuan)標準(zhun)菌(jun)株(zhu)和(he)臨床菌(jun)株(zhu)的特(te)異(yi)性(xing)驗證，確保(bao)在(zai)使(shi)用(yong)過(guo)程中(zhong)不會(hui)出現任(ren)何的假(jia)陽(yang)性(xing)及假(jia)陰性(xing)報告(gao)結果。

提(ti)取步(bu)驟(zhou)：

1.從負(fu)八(ba)十冰箱(xiang)取(qu)出(chu)樣(yang)品，放置於冰(bing)上(shang)緩(huan)慢解凍(dong)； （提前(qian)預冷離(li)心(xin)機(ji)至4度(du)）

2.待(dai)解凍(dong)後(hou)（紅色(se)），加(jia)入200 μl氯仿(fang)（加(jia)入氯仿(fang)體(ti)積(ji)為(wei)Trizol體積(ji)的1/5），劇烈震蕩(dang)（乳白(bai)紅(hong)色(se)），冰(bing)上(shang)靜(jing)置10 min。 （氯仿(fang)為(wei)有(you)機(ji)溶劑(ji)，有(you)效(xiao)的使(shi)有(you)機(ji)相和(he)無(wu)機(ji)相迅(xun)速分離(li)。有(you)機(ji)相中(zhong)主(zhu)要(yao)是(shi)酚和(he)蛋(dan)白(bai)結合(he)，從而(er)使(shi)得(de)蛋(dan)白(bai)和(he)RNA脫(tuo)離(li)，RNA進入水相。）

3.放(fang)置於預(yu)冷離(li)心(xin)機(ji)，離(li)心(xin)（4度(du)，12000 rpm，15 min），離(li)心(xin)後(hou)可見(jian)明(ming)顯分三(san)層（上層(ceng)無色(se)透(tou)明(ming)水相為(wei)RNA層，中(zhong)間很(hen)薄(bo)的乳白(bai)色(se)為(wei)DNA層，下(xia)層(ceng)為(wei)紅色(se)為(wei)蛋(dan)白(bai)層(ceng)）。

4.小(xiao)心緩(huan)慢吸(xi)取上(shang)清，約(yue)400 μl（寧(ning)可(ke)少(shao)吸(xi)，也不要(yao)多吸(xi)取），置於另(ling)壹(yi)個(ge)新的1.5 ml RNase-free EP管(guan)中(zhong)，加入等(deng)體積(ji)的異(yi)丙(bing)醇(chun)，上(shang)下(xia)顛(dian)倒混(hun)勻(yun)，常(chang)溫(wen)靜(jing)置放置15 min。

5.離(li)心(xin)（4度(du)，12000 rpm，15 min），可(ke)見(jian)白(bai)色(se)沈(chen)澱（有(you)時細(xi)胞較少(shao)看不到(dao)沈(chen)澱，可放置負二(er)十或負八(ba)十兩小時再繼(ji)續(xu)後(hou)面步(bu)驟(zhou)）

6.棄(qi)上清(qing)，每管(guan)加(jia)入950 ul 75% 乙(yi)醇(chun)，上(shang)下(xia)顛(dian)倒混(hun)勻(yun)（切(qie)記(ji)不要(yao)用槍(qiang)吹打混(hun)勻，這樣(yang)會造(zao)成RNA溶解）。

7.離(li)心(xin)（4度(du)，12000 rpm，10 min），可(ke)見(jian)底(di)部(bu)明(ming)顯白(bai)色(se)沈(chen)澱。

8.離(li)心(xin)後(hou)，棄(qi)掉上(shang)清(qing)，放(fang)入離(li)心(xin)機(ji)再次(ci)瞬離(li)，用(yong)10 μl 的移(yi)液器(qi)洗去殘留液體， 開(kai)蓋(gai)晾(liang)幹（約(yue)5 min）。

9.每(mei)個樣(yang)品根據(ju)沈(chen)澱大小加(jia)入適量DEPC水（壹(yi)般20~30 μl，有(you)時看不到(dao)沈(chen)澱，可加10 μl DEPC水溶解(jie)），吹打溶(rong)解RNA，十壹(yi)樓(lou)酶標儀(yi)測濃度(du)，OD值(zhi)（260/280=1.8-2.0）標記(ji)，負八(ba)十保(bao)存。

備註：對於中(zhong)性(xing)粒(li)細(xi)胞提取(qu)RNA建(jian)議(yi)細(xi)胞數目(mu)大於2x106/樣(yang)品；

備註：操(cao)作過(guo)程中(zhong)佩(pei)戴(dai)口罩(zhao)。

PCR反(fan)應(ying)五要(yao)素：
參(can)加PCR反(fan)應(ying)的物(wu)質(zhi)主(zhu)要(yao)有(you)五種即引物、酶、dNTP、模板(ban)和(he)Mg2+
引(yin)物： 引(yin)物是(shi)PCR特異(yi)性(xing)反應(ying)的關(guan)鍵(jian)，PCR 產(chan)物(wu)的特(te)異(yi)性(xing)取決(jue)於引(yin)物(wu)與(yu)模板(ban)DNA互補(bu)的程度(du)。理論上(shang)，只(zhi)要(yao)知道(dao)任(ren)何壹(yi)段模板(ban)DNA序列，就能(neng)按其(qi)設(she)計互補(bu)的寡(gua)核(he)苷(gan)酸(suan)鏈(lian)做(zuo)引(yin)物(wu)，利(li)用PCR就可將模板(ban)DNA在(zai)體(ti)外大量擴增(zeng)。
設(she)計引物(wu)應(ying)遵(zun)循以下(xia)原(yuan)則：
①引(yin)物長(chang)度(du)： 15-30bp，常用為(wei)20bp左右(you)。
②引(yin)物擴增(zeng)跨度： 以200-500bp為(wei)宜，特(te)定(ding)條(tiao)件下(xia)可(ke)擴增(zeng)長(chang)至(zhi)10kb的片(pian)段。
③引(yin)物堿(jian)基：G+C含(han)量(liang)以40-60%為(wei)宜，G+C太(tai)少(shao)擴增(zeng)效(xiao)果不佳(jia)，G+C過(guo)多(duo)易(yi)出(chu)現非(fei)特異(yi)條(tiao)帶(dai)。ATGC好(hao)隨(sui)機(ji)分布，避(bi)免(mian)5個以上的嘌(piao)呤(ling)或嘧啶(ding)核(he)苷(gan)酸(suan)的成(cheng)串(chuan)排列。
④避(bi)免(mian)引物內部(bu)出(chu)現二(er)級結構，避(bi)免(mian)兩條引物間互補(bu)，特(te)別是(shi)3’端的互補(bu)，否(fou)則會形(xing)成引(yin)物二(er)聚(ju)體，產(chan)生(sheng)非(fei)特異(yi)的擴增(zeng)條帶。
⑤引(yin)物3’端的堿(jian)基，特別(bie)是(shi) 末及倒(dao)數 個(ge)堿基，應(ying)嚴(yan)格要(yao)求(qiu)配(pei)對，以避(bi)免(mian)因末端堿基不配(pei)對而導(dao)致(zhi)PCR失(shi)敗。
⑥引(yin)物中(zhong)有(you)或能加上合(he)適的酶切(qie)位點，被擴增(zeng)的靶(ba)序(xu)列(lie) 有(you)適宜(yi)的酶切(qie)位點，這對酶切(qie)分析或分子(zi)克(ke)隆很(hen)有(you)好處(chu)。
⑦引(yin)物的特(te)異(yi)性(xing)：引物(wu)應(ying)與(yu)核(he)酸(suan)序(xu)列數據(ju)庫(ku)的其(qi)它(ta)序列無(wu)明(ming)顯同源性(xing)。

註(zhu)意(yi)事(shi)項(xiang): 

1． 試(shi)劑(ji)盒從冷藏環(huan)境中(zhong)取(qu)出應(ying)在(zai)室(shi)溫(wen)平(ping)衡(heng)15-30分鐘後(hou)方可使(shi)用(yong)，酶標包(bao)被板開封後(hou)如未用(yong)完(wan)，板(ban)條(tiao)應(ying)裝(zhuang)入密(mi)封袋(dai)中保(bao)存。濃洗滌液可能(neng)會(hui)有(you)結晶析出(chu)，稀釋時(shi)可在(zai)水浴中加(jia)溫(wen)助溶，洗滌時不影(ying)響(xiang)結果。

2.各(ge)步(bu)加樣(yang)均(jun)應(ying)使(shi)用(yong)加(jia)樣(yang)器(qi)，並(bing)經(jing)常(chang)校(xiao)對其準(zhun)確性(xing)，以避(bi)免(mian)試(shi)驗誤(wu)差(cha)。壹(yi)次(ci)加樣(yang)時間控制在(zai)5分鐘內，如標本(ben)數量(liang)多，推(tui)薦(jian)使(shi)用(yong)排槍加樣(yang)。

3.請每(mei)次(ci)測定(ding)的同時做(zuo)標準(zhun)曲線(xian)，做(zuo)復(fu)孔(kong)。如標本(ben)中待(dai)測物(wu)質(zhi)含(han)量(liang)過(guo)高(gao)（樣(yang)本OD值(zhi)大於標準(zhun)品孔(kong)di壹(yi)孔(kong)的OD值(zhi)），請先(xian)用(yong)樣(yang)品稀釋液稀釋壹(yi)定(ding)倍數（n倍）後(hou)再測定，計算時請再(zai)乘(cheng)以總稀(xi)釋倍數（×n×5）。

4.封(feng)板膜(mo)只(zhi)限(xian)壹(yi)次(ci)性(xing)使(shi)用(yong)，以避(bi)免(mian)交(jiao)叉(cha)汙染(ran)。

5.底(di)物請避(bi)光(guang)保(bao)存。

6.嚴(yan)格按照說(shuo)明(ming)書(shu)的操(cao)作(zuo)進行，試(shi)驗結果判定必須(xu)以酶標儀(yi)讀數為(wei)準.

7.所有(you)樣(yang)品，洗滌液和(he)各(ge)種(zhong)廢(fei)棄(qi)物都(dou)應(ying)按(an)傳染物處(chu)理。

8.本(ben)試(shi)劑(ji)不同批(pi)號組分不得(de)混用(yong)。

9.不能(neng)使(shi)用(yong)過(guo)期(qi)產(chan)品。

10. 如與英(ying)文(wen)說(shuo)明(ming)書(shu)有(you)異(yi)，以英(ying)文(wen)說(shuo)明(ming)書(shu)為(wei)準。