要(yao)使 ELISA 測定得(de)到(dao)準確(que)的結果(guo)，不(bu)論(lun)是定性(xing)的還是(shi)定量(liang)的，必須嚴格按照(zhao)規定的方法制(zhi)備(bei)試(shi)劑(ji)和(he)實(shi)施(shi)測定。主(zhu)要(yao)試(shi)劑(ji)的制備(bei)要(yao)點(dian)已(yi)如前(qian)述(shu)，其(qi)他(ta)壹般(ban)性(xing)試(shi)劑(ji)，如包被(bei)緩(huan)沖液(ye)、洗滌液(ye)、標(biao)本(ben)稀(xi)釋(shi)液(ye)、結(jie)合(he)物(wu)稀釋(shi)液(ye)、底(di)物(wu)工作液(ye)和(he)酶(mei)反(fan)應(ying)終(zhong)止(zhi)液(ye)等，配(pei)制時(shi)不(bu)可掉以(yi)輕心。緩(huan)沖液(ye)可於冰箱中短(duan)期保存(cun)，使用(yong)前(qian)應(ying)觀(guan)察(cha)是(shi)否變質。蒸餾(liu)水(shui)的質量(liang)在 ELISA 中也(ye)至關(guan)重(zhong)要(yao)，最好(hao)使用(yong)新(xin)鮮(xian)重蒸餾(liu)的。不合(he)格(ge)的蒸餾(liu)水(shui)可使空(kong)白(bai)值(zhi)升(sheng)高(gao)。測定的實(shi)施(shi)中，應(ying)力求(qiu)各個(ge)步驟(zhou)操作的標(biao)準化(hua)，下面(mian)以(yi)板(ban)式 ELISA 為例(li)，介(jie)紹有(you)關(guan)註(zhu)意(yi)事(shi)項(xiang)。

（壹）加樣(yang)

在(zai) ELISA 中除(chu)了(le)包被(bei)外(wai)，壹般(ban)需進行(xing) 45 加樣(yang)。在(zai)定性(xing)測定中有(you)時(shi)不(bu)強(qiang)調(tiao)加樣(yang)量(liang)的準確(que)性(xing)，例如(ru)規定為加樣(yang)壹滴。此(ci)時應(ying)該(gai)使用(yong)相(xiang)同(tong)口徑的滴管，保持(chi)準確(que)的加樣(yang)姿(zi)勢(shi)，使每(mei)滴液(ye)體(ti)的體(ti)積基(ji)本(ben)相(xiang)同(tong)。在定量(liang)測定中則(ze)加樣(yang)量(liang)應(ying)力求(qiu)準確(que)。標(biao)本(ben)和(he)結(jie)合(he)物(wu)的稀釋(shi)液(ye)應(ying)按規定配制(zhi)。加樣(yang)時(shi)應(ying)將(jiang)液(ye)體(ti)加在(zai)孔底(di)，避(bi)免(mian)加在(zai)孔壁(bi)上(shang)部，並(bing)註(zhu)意(yi)不(bu)可出(chu)現(xian)氣泡。

（二）保溫

在(zai) ELISA 中壹般(ban)有(you)二次(ci)抗(kang)原抗(kang)體(ti)反(fan)應(ying)，即(ji)加標(biao)本(ben)後和(he)加結(jie)合物(wu)後，此(ci)時反(fan)應(ying)的溫度(du)和(he)時(shi)間(jian)應(ying)按規定的要求(qiu)，保溫容(rong)器最(zui)好(hao)是(shi)水(shui)浴箱，可使溫度(du)迅速(su)平衡。各(ge) ELISA 板(ban)不應(ying)疊在(zai)壹起(qi)。為避(bi)免(mian)蒸(zheng)發，板(ban)上(shang)應(ying)加蓋(gai)，或(huo)將(jiang)板(ban)平放在(zai)底部墊(dian)有(you)濕紗布(bu)的濕盒中。濕盒應(ying)該(gai)是(shi)金屬(shu)的，傳熱容(rong)易。如(ru)用(yong)保溫箱，空濕盒應(ying)預(yu)先(xian)放(fang)在(zai)其(qi)中，以(yi)平衡溫度(du)，這在室(shi)溫較低(di)時(shi)更(geng)為重(zhong)要(yao)。加入底物(wu)後，反(fan)應(ying)的時間(jian)和(he)溫度(du)通常不(bu)做嚴格要求(qiu)。如室(shi)溫高(gao)於(yu) 20℃，ELISA 板(ban)可避光放在實(shi)驗(yan)臺上(shang)，以(yi)便不(bu)時觀(guan)察(cha)，待(dai)對照(zhao)管顯色適(shi)當(dang)時(shi)，即(ji)可終(zhong)止(zhi)酶(mei)反(fan)應(ying)。

（三(san)）洗滌

洗滌在 ELISA 過程中不(bu)是(shi)反(fan)應(ying)聚(ju)，但卻(que)是決定實(shi)驗(yan)成敗(bai)的關(guan)鍵(jian)。洗滌的目的是洗去反(fan)應(ying)液(ye)中沒(mei)有(you)與(yu)固(gu)相抗(kang)原或(huo)抗(kang)體(ti)結(jie)合的物(wu)質以(yi)及在(zai)反(fan)應(ying)過程中非(fei)特(te)異性(xing)吸(xi)附(fu)於(yu)固(gu)相載體(ti)的幹(gan)擾(rao)物(wu)質。聚(ju)苯乙(yi)烯待(dai)塑料對蛋(dan)白(bai)質的吸(xi)附(fu)作用(yong)是(shi)普(pu)遍性(xing)的。

因(yin)此(ci)在 ELISA 測定的反(fan)應(ying)過程中應(ying)盡(jin)量(liang)避免(mian)非(fei)特異性(xing)吸(xi)附(fu)，而(er)在(zai)洗滌時又(you)應(ying)把(ba)這(zhe)種非特異(yi)性(xing)吸(xi)附(fu)的幹(gan)擾(rao)物(wu)質洗滌下來。在(zai)標(biao)本(ben)和(he)結(jie)合(he)物(wu)的稀釋(shi)液(ye)和(he)洗滌液(ye)中加入聚(ju)山(shan)梨(li)酯(zhi)（吐(tu)溫，Tween）壹類物(wu)質即(ji)右(you)達(da)到(dao)此(ci)目的。聚(ju)山(shan)梨(li)酯(zhi)是(shi)聚(ju)氧乙(yi)烯去(qu)水(shui)脂(zhi)肪(fang)酸(suan)酯，為非(fei)離子(zi)型(xing)的表面(mian)張(zhang)力物(wu)質，常(chang)作為助(zhu)溶劑(ji)。根據(ju)脂(zhi)肪(fang)酸(suan)的種類而(er)對聚(ju)山(shan)梨(li)酯(zhi)編(bian)號，結合(he)月(yue)桂(gui)酸(suan)的為聚(ju)山(shan)梨(li)酯(zhi) 20，在(zai) ELISA 中最(zui)為常(chang)用(yong)。它(ta)的洗滌效果(guo)好(hao)，並(bing)具有(you)減(jian)少(shao)非(fei)特(te)異性(xing)吸(xi)附(fu)和(he)增(zeng)強(qiang)抗(kang)原抗(kang)體(ti)結(jie)合的作用(yong)。

洗滌如不(bu)*，特(te)別(bie)在(zai)最(zui)後壹次(ci)，如有(you)酶(mei)結(jie)合(he)物(wu)的非特(te)異(yi)性(xing)吸(xi)附(fu)，將(jiang)使空(kong)白(bai)值(zhi)升(sheng)高(gao)。另(ling)外(wai)，在(zai)間(jian)接(jie)法中如(ru)血(xue)清標(biao)本(ben)內(nei)的非特(te)異(yi)性(xing) IgG 吸(xi)附(fu)在(zai)固(gu)相上(shang)而未被(bei)洗凈，也(ye)將(jiang)與(yu)酶標(biao)抗(kang)體(ti)作用(yong)而(er)產(chan)生幹(gan)擾(rao)。

ELISA 板(ban)的洗滌壹般(ban)可采用(yong)以(yi)下方法：①吸(xi)幹(gan)孔(kong)內(nei)反(fan)應(ying)液(ye)；②將(jiang)洗滌液(ye)註(zhu)滿(man)板(ban)孔；③放(fang)置 2 min，略作搖動(dong)；④吸(xi)幹(gan)孔(kong)內(nei)液(ye)，也(ye)可傾(qing)去液(ye)體(ti)後在吸(xi)水(shui)紙(zhi)上(shang)拍幹(gan)。洗滌的次(ci)數壹般(ban)為 3～4 次(ci)，有(you)時(shi)甚(shen)至(zhi)需洗 5～6 次(ci)。

（四(si)）比色

如(ru)陰(yin)性(xing)對照(zhao)顏色極(ji)淺(qian)，在定性(xing)測定中壹般(ban)可采用(yong)目視比色。如(ru)用(yong)比色計測定結果(guo)，準確(que)性(xing)決定於 ELISA 板(ban)底的平整與透(tou)明度(du)和(he)比色計的質量(liang)。