實驗開始前，各(ge)試(shi)劑(ji)和樣(yang)本均應平(ping)衡(heng)至(zhi)室(shi)溫；樣本復(fu)融(rong)後需再(zai)次離(li)心(xin)，取(qu)上清檢測(ce)；試(shi)劑(ji)或樣(yang)本配(pei)制(zhi)時，需充分混(hun)勻(yun)並(bing)盡(jin)量避免起(qi)泡(pao)；標(biao)曲和樣(yang)本建(jian)議做復孔檢測(ce)。

1. 加(jia)樣：將(jiang)標(biao)準品(pin)工作(zuo)液依次(ci)加(jia)入到(dao)前兩(liang)列(lie)孔中，每(mei)個濃度(du)的工作(zuo)液並(bing)列(lie)加兩(liang)孔，每(mei)孔50 μL。待測樣(yang)品(pin)加入到(dao)其(qi)他孔(kong)，每(mei)孔50 μL(若樣(yang)本濃度(du)高(gao)於(yu)檢測(ce)範(fan)圍，需用(yong)標(biao)準品(pin)&樣本稀(xi)釋(shi)液稀(xi)釋(shi)後(hou)取(qu)樣)。立即每(mei)孔加(jia)入配好的化抗體(ti)工(gong)作(zuo)液50 μL。混(hun)勻(yun)，給(gei)酶標(biao)板覆(fu)膜(mo)，37℃孵育45分鐘(zhong)。提(ti)示(shi)：加(jia)樣(yang)時(shi)將樣品加於(yu)酶標(biao)板底(di)部(bu)，盡(jin)量不(bu)觸(chu)及孔壁，輕輕晃(huang)動(dong)混(hun)勻(yun)，避(bi)免產(chan)生(sheng)氣(qi)泡。加樣時(shi)間(jian)宜(yi)控制(zhi)在(zai)10分鐘(zhong)內(nei)。
2. 洗(xi)滌：甩盡(jin)孔(kong)內(nei)液體(ti)，每(mei)孔加(jia)洗(xi)滌液350 μL，浸(jin)泡1-2分鐘(zhong)，吸去或甩掉酶標(biao)板內(nei)的液體(ti)，在(zai)厚(hou)的吸水紙(zhi)上拍(pai)幹(gan)。重復(fu)此洗(xi)板步(bu)驟3次。提(ti)示(shi)：此處(chu)與(yu)其(qi)他洗(xi)板步(bu)驟都可(ke)用(yong)洗(xi)板機(ji)。每(mei)壹步(bu)洗(xi)滌充分是(shi)實驗的根(gen)本。

3. HRP酶結合(he)物(wu)：每(mei)孔加(jia)酶結合(he)物(wu)工(gong)作(zuo)液100 μL，混(hun)勻(yun)，加(jia)上覆(fu)膜(mo)，37℃孵育30分鐘(zhong)。

4. 洗(xi)滌：棄去孔內(nei)液體(ti)，洗(xi)板5次(ci)，方法同步驟2。

5. 底(di)物(wu)：每(mei)孔加(jia)底(di)物(wu)溶(rong)液(TMB) 90 μL，混(hun)勻(yun)，加(jia)上覆(fu)膜(mo)，37℃避光孵育(yu)15分鐘(zhong)左(zuo)右。提(ti)示(shi)：根(gen)據(ju)實際顯(xian)色情(qing)況酌(zhuo)情(qing)縮(suo)短(duan)或延長孵(fu)育(yu)時(shi)間(jian)，但(dan)不(bu)可(ke)超過30分鐘(zhong)。當(dang)標(biao)準孔(kong)出(chu)現(xian)明顯梯(ti)度(du)時，即可(ke)終(zhong)止(zhi)。

6. 終(zhong)止(zhi)：每(mei)孔加(jia)終(zhong)止(zhi)液50 μL，終(zhong)止(zhi)反(fan)應。提(ti)示(shi)：終(zhong)止(zhi)液的加入順(shun)序應盡(jin)量與底(di)物(wu)溶(rong)液的加入順(shun)序相同(tong)。

7. 讀(du)值：立(li)即用(yong)酶標(biao)儀(yi)在450 nm波(bo)長測(ce)量各孔的光密度(du)(OD值)。應提(ti)前打(da)開酶標(biao)儀(yi)預熱(re)，設置好檢測(ce)程(cheng)序。

8. 實驗完(wan)畢(bi)後(hou)，將(jiang)未(wei)用(yong)完(wan)的試(shi)劑(ji)按規(gui)定(ding)的保(bao)存溫度(du)放回(hui)冰箱(xiang)保(bao)存至(zhi)保(bao)質期。