酶ELISA試(shi)劑(ji)盒(he)，即(ji)酶聯免疫吸附試驗試劑(ji)盒(he)，是酶免疫測(ce)定技(ji)術(shu)中應(ying)用廣的(de)技(ji)術(shu)。基本(ben)原(yuan)理是酶分子與(yu)抗體或(huo)抗抗體分(fen)子共價結(jie)合(he)，這種(zhong)結(jie)合(he)不會(hui)改(gai)變(bian)抗體的(de)免(mian)疫學(xue)特性，也不影響(xiang)酶(mei)的生物學(xue)活性。酶(mei)標(biao)記的(de)抗體可以(yi)與吸附在(zai)固相(xiang)載體上(shang)的抗原(yuan)或抗體發生特異(yi)性結(jie)合(he)。在(zai)加入底物(wu)溶液(ye)後(hou)，底物(wu)在(zai)酶的(de)作用(yong)下發生顏色(se)反(fan)應(ying)，其顏(yan)色(se)深(shen)淺與(yu)標(biao)本(ben)中相應(ying)抗體或(huo)抗原(yuan)的量呈(cheng)正比(bi)。這種(zhong)顯(xian)色(se)反(fan)應(ying)可以(yi)通(tong)過ELISA檢測(ce)儀進(jin)行定量測(ce)定，從(cong)而(er)將酶(mei)化學(xue)反(fan)應(ying)的敏(min)感(gan)性和(he)抗原(yuan)抗體反(fan)應(ying)的特(te)異(yi)性結(jie)合(he)起(qi)來。
1、樣本(ben)準(zhun)備(bei)
樣本(ben)收集：根(gen)據(ju)實(shi)驗要求確(que)定所需的樣(yang)本(ben)量，並確(que)保(bao)樣本(ben)的(de)完(wan)整性和(he)代(dai)表(biao)性。例如，每個樣(yang)本(ben)量收集體積=100ulx檢測(ce)種(zhong)類(lei)，如果需要復(fu)孔，則(ze)標(biao)本(ben)量收集體積=100ulx檢測(ce)種(zhong)類(lei)x2。
樣本(ben)保(bao)存：樣本(ben)收集後(hou)若(ruo)在(zai)壹(yi)周(zhou)內進行檢測(ce)可保(bao)存於2-8°C，若(ruo)不及時檢測(ce)，請進(jin)行分裝(zhuang)，凍(dong)存於-20°或-80°C，避(bi)免(mian)反(fan)復凍(dong)融。
樣本(ben)處(chu)理：血(xue)清樣(yang)本(ben)取(qu)樣(yang)時要(yao)註(zhu)意(yi)避(bi)免(mian)溶(rong)血(xue)、脂血(xue)等(deng)樣(yang)本(ben)。如(ru)樣(yang)本(ben)條(tiao)件(jian)受(shou)限(xian)，建(jian)議(yi)用(yong)樣(yang)本(ben)稀(xi)釋液(ye)適(shi)當(dang)稀釋，減(jian)少基質效應(ying)影響(xiang)。
2、試(shi)劑(ji)準(zhun)備(bei)
試劑(ji)平(ping)衡：ELISA試(shi)劑(ji)盒(he)從(cong)冷藏(zang)環境(jing)中取(qu)出(chu)應(ying)在(zai)室溫(wen)平(ping)衡15-30分(fen)鐘(zhong)後(hou)方可使(shi)用(yong)。
標(biao)準品(pin)制(zhi)備(bei)：溶解(jie)標(biao)準品(pin)之(zhi)前需短暫(zan)離(li)心，徹d收集粉(fen)末；確(que)保(bao)標(biao)準品(pin)完(wan)q溶解(jie)和(he)混(hun)勻（大(da)約(yue)10min），然後(hou)再進(jin)行後(hou)續的(de)系(xi)列稀(xi)釋步驟，確(que)保(bao)每壹(yi)步都(dou)充分混(hun)勻且精確(que)移(yi)液(ye)。
洗滌(di)液(ye)配制：濃洗滌(di)液(ye)可能會(hui)有結(jie)晶析(xi)出(chu)，稀釋時可在(zai)水浴(yu)中加溫(wen)助(zhu)溶，洗滌(di)時不影響(xiang)結(jie)果(guo)。
3、實(shi)驗操作
加樣準(zhun)確(que)性：各(ge)步加樣均應(ying)使(shi)用(yong)加樣器(qi)，並經(jing)常(chang)校(xiao)對(dui)其準(zhun)確(que)性，以(yi)避(bi)免(mian)試(shi)驗誤差(cha)。壹(yi)次加樣時間(jian)控(kong)制在(zai)5分鐘(zhong)內，如標(biao)本(ben)數(shu)量多，推薦使(shi)用(yong)排(pai)槍(qiang)加樣。
孵(fu)育和(he)洗滌(di)：孵育樣(yang)品(pin)、檢測(ce)抗體和(he)顯(xian)色(se)底物(wu)均需要覆(fu)蓋(gai)封板(ban)膜，減少汙(wu)染(ran)和(he)揮(hui)發，且每次使(shi)用(yong)後(hou)都(dou)要更(geng)換新的(de)封板(ban)膜，防止交叉(cha)汙(wu)染(ran)。振(zhen)蕩孵(fu)育(yu)使(shi)反(fan)應(ying)更(geng)充分，振(zhen)蕩洗滌(di)使(shi)背(bei)景(jing)更(geng)幹凈。
終止反(fan)應(ying)：ELISA實(shi)驗最終需要酶(mei)催(cui)化底物(wu)顯(xian)色(se)反(fan)應(ying)來完(wan)成(cheng)，在(zai)最合(he)適的(de)時間(jian)終止反(fan)應(ying)是ELISA實(shi)驗成(cheng)功的(de)重(zhong)要(yao)因素(su)。在(zai)HRP-TMB酶反(fan)應(ying)系(xi)統中，當(dang)最高(gao)濃度(du)標(biao)準品(pin)顏(yan)色(se)不再變(bian)深(shen)，倒(dao)數(shu)2-3個濃度(du)標(biao)準品(pin)顏(yan)色(se)開始有(you)淺藍(lan)色(se)時，便需要終止反(fan)應(ying)。
4、質量控制
標(biao)準曲(qu)線：每次測(ce)定的(de)同(tong)時做(zuo)標(biao)準曲(qu)線，做復(fu)孔。如(ru)標(biao)本(ben)中待測(ce)物質含量過高(gao)(樣本(ben)OD值(zhi)大(da)於標(biao)準品(pin)孔最(zui)大(da)孔的(de)OD值(zhi))，請先用樣(yang)品(pin)稀(xi)釋液(ye)稀(xi)釋壹(yi)定倍數後(hou)再測(ce)定，計(ji)算(suan)時請(qing)乘(cheng)以(yi)總稀釋倍數。
數據讀(du)取(qu)：ELISA數(shu)據處(chu)理有專門的軟(ruan)件，並(bing)且要核對(dui)說明(ming)書(shu)選擇合適(shi)的擬合曲線。
交叉(cha)汙(wu)染(ran)防控(kong)：所有(you)試劑(ji)和(he)檢測(ce)樣本(ben)要(yao)平(ping)衡至(zhi)室(shi)溫(wen)後(hou)再進(jin)行加樣操作；每次洗滌(di)的步驟都(dou)要洗幹凈，如(ru)果是手(shou)動(dong)洗滌(di)，每次拍(pai)板用(yong)的濾(lv)紙(zhi)都(dou)要更(geng)換，防止交叉(cha)汙(wu)染(ran)。
5、環境(jing)要(yao)求(qiu)
溫(wen)度(du)控(kong)制：溫(wen)度(du)是ELISA結(jie)合(he)反(fan)應(ying)的重(zhong)要(yao)影(ying)響(xiang)因素(su)。實(shi)驗前務必(bi)將所有(you)試劑(ji)和(he)檢測(ce)樣本(ben)平(ping)衡至(zhi)室(shi)溫(wen)，避(bi)免(mian)因溫(wen)度(du)差(cha)異(yi)導(dao)致(zhi)ELISA檢測(ce)結(jie)果(guo)不準確(que)。
濕度(du)管(guan)理：試劑(ji)盒(he)應(ying)避(bi)免(mian)潮(chao)濕，過高(gao)濕度(du)會(hui)使(shi)酶(mei)標(biao)板變(bian)形、變(bian)質，影響(xiang)檢測(ce)結(jie)果(guo)。要放在(zai)幹燥、通(tong)風(feng)的地方。在(zai)使(shi)用(yong)試(shi)劑(ji)盒(he)的(de)過程(cheng)中，也要(yao)註(zhu)意(yi)保(bao)持操作環境(jing)的(de)幹燥。
