PCR反應條件為溫(wen)度(du)、時(shi)間(jian)和循環(huan)次(ci)數。

　　溫(wen)度(du)與時(shi)間(jian)的設(she)置：基(ji)於(yu)PCR原(yuan)理(li)三(san)步(bu)驟而設(she)置變性(xing)-退火-延伸(shen)三(san)溫(wen)度(du)點(dian)。在標(biao)準(zhun)反(fan)應中(zhong)采(cai)用三(san)溫(wen)度(du)點(dian)法，雙(shuang)鏈(lian)DNA在90～95℃變性(xing)，再(zai)迅(xun)速冷卻(que)至(zhi)40 ～60℃，引(yin)物(wu)退火並結(jie)合(he)到(dao)靶序列(lie)上，然(ran)後快速(su)升(sheng)溫(wen)至(zhi)70～75℃，在(zai)Taq DNA 聚(ju)合(he)酶(mei)的(de)作(zuo)用下，使引(yin)物鏈(lian)沿模板延伸(shen)。對(dui)於(yu)較短靶基(ji)因(yin)（長度(du)為100～300bp時(shi)）可(ke)采(cai)用二(er)溫(wen)度(du)點(dian)法，除變性(xing)溫(wen)度(du)外、退火與延伸(shen)溫(wen)度(du)可合(he)二(er)為壹(yi)，壹(yi)般(ban)采(cai)用94℃變性(xing)，65℃左右(you)退火與延伸(shen)（此溫(wen)度(du)Taq DNA酶仍(reng)有較(jiao)高(gao)的催化活性(xing)）。PCR反(fan)應條件配(pei)置如下(xia)：

1.  PCR反應的緩沖(chong)液提(ti)供(gong)合(he)適(shi)的(de)酸(suan)堿度(du)與某(mou)些(xie)離(li)子(zi) 。

2.  鎂離(li)子(zi)濃度(du)總(zong)量(liang)應比(bi)dNTPs的(de)濃度(du)高(gao)，常用1.5 mmol/L。

3.  底(di)物(wu)濃度(du)dNTP以等(deng)摩爾濃度(du)配(pei)制，20～200 umol/L。

4.  TaqDNA聚(ju)合(he)酶(mei)2.5U(100 ul）。　

5.  引(yin)物(wu) 濃度(du)壹(yi)般(ban)為(wei)0.1 ～0.5 umol/L。　

6.  反(fan)應溫(wen)度(du)

（1）變性(xing)溫(wen)度(du)和時(shi)間(jian)95℃，30 s。

（2）退火溫(wen)度(du)和時(shi)間(jian) 低於(yu)引物(wu)Tm值(zhi)5 ℃左右(you)，壹(yi)般(ban)在(zai)45～55℃。

（3）延伸(shen)溫(wen)度(du)和時(shi)間(jian)72℃，1 min/kb(10 kb內(nei)）。

（4）Tm值(zhi)=4(G+C) +2(A+T)。

7.  循環(huan)次數

壹(yi)般(ban)為(wei)25 ～30次(ci)。循(xun)環數決定(ding)PCR擴增(zeng)的(de)產(chan)量(liang)。模板初始濃度(du)低，可(ke)增加循環(huan)數以便(bian)達到(dao)有效(xiao)的(de) 擴增(zeng)量(liang)。但循(xun)環數並不(bu)是(shi)可(ke)以(yi)無(wu)限增(zeng)加的。壹(yi)般(ban)循(xun)環(huan)數為30個左右(you)，循(xun)環(huan)數超過30個以後，DNA聚(ju)合(he)酶(mei)活(huo)性(xing)逐漸達到(dao)飽(bao)和，產(chan)物的(de)量(liang)不(bu)再(zai)隨(sui)循(xun)環(huan)數的增(zeng)加而增(zeng)加，出(chu)現(xian)了所(suo)謂的(de)“平臺(tai)期"。