酶聯(lian)免疫(yi)吸附(fu)測(ce)定(ding)（enzyme linked immunosorbent assay，簡(jian)寫(xie)ELISA）指將可溶(rong)性的(de)抗原或(huo)抗體(ti)結合到(dao)聚苯(ben)乙(yi)烯(xi)等(deng)固(gu)相(xiang)載(zai)體(ti)上(shang)，利(li)用抗原抗體(ti)特(te)異性結合進(jin)行(xing)免疫(yi)反應(ying)的(de)定性和(he)定(ding)量(liang)檢測(ce)方(fang)法(fa)。
 

　　壹(yi)、包(bao)被(bei)抗原
 

　　1.   用 50mM  的(de)碳酸(suan)鹽(yan)包被(bei)緩(huan)沖液(pH 9.6)溶解抗原，使(shi)抗原濃度(du)為(wei) 10-20 μg/ ml， 加 100 μl/孔到 96 孔酶標板(ban)， 4 oC 放置過(guo)夜。
 

　　2.   第(di)二(er)天棄去包(bao)被(bei)液(ye)後(hou)， 用 PBST 洗(xi)滌 3 次(ci)，每(mei)孔(kong)加入 150 μl  1% BSA 37 oC封閉(bi) 1 小(xiao)時。
 

　　3.   PBST 洗(xi)滌(di) 3 次後(hou)，每(mei)孔(kong)加入 100 μl 不同(tong)倍比稀(xi)釋(shi)度(du)的(de)血清(qing)，並(bing)加入對(dui)照(zhao)樣(yang)品(pin)， 37 oC 孵(fu)育(yu) 2 小(xiao)時。
 

　　4.   PBST 洗(xi)滌(di) 5 次後(hou)，加入 100μl 稀釋(shi)後(hou)的(de) HRP 標記的(de)二抗，37 oC 孵(fu)育(yu) 1 小(xiao)時。
 

　　5.   PBST 洗(xi)滌(di) 5 次後(hou)，顯(xian)色(se)劑顯色(se) 20min 後(hou)，酶標儀(yi)上讀取(qu) A405 吸收(shou)值(zhi)。
 

　　二、包被(bei)細(xi)胞(bao)
 

　　1.   在(zai) 96 孔培(pei)養板(ban)上(shang)接(jie)種細(xi)胞(bao)數(shu)為 1 x 104  cells/well ，37℃過夜(ye)培(pei)養。
 

　　2.   第二(er)天用 PBS 洗(xi)滌培(pei)養板(ban) 2-3 次(ci)。
 

　　3.   加入 125 µl/well 10% Formalin(1:10 稀釋(shi)) , 室溫(wen)下固(gu)定(ding) 15 min。
 

　　4.   用 ddH2O 洗(xi)滌培(pei)養板(ban) 3 次(ci)，並(bing)晾(liang)幹，儲藏(zang)在(zai) 2-8oC 備用。
 

　　5.   用 PBST 洗(xi)滌 3 次(ci)，每(mei)孔(kong)加入 150 μl 1% BSA 37 oC 封閉(bi) 1 小(xiao)時。
 

　　6.   PBST 洗(xi)滌(di) 3 次後(hou)，每(mei)孔(kong)加入 100 μl 不同(tong)倍比稀(xi)釋(shi)度(du)的(de)血清(qing)，並(bing)加入對(dui)照(zhao)樣(yang)品(pin)， 37 oC 孵(fu)育(yu) 2 小(xiao)時。
 

　　7.   PBST 洗(xi)滌(di) 5 次後(hou)， 加入 100 μl 稀釋(shi)後(hou)的(de) HRP 標記的(de)二抗,37 oC 孵(fu)育(yu) 1 小(xiao)時。
 

　　8.   PBST 洗(xi)滌(di) 5 次後(hou)，顯(xian)色(se)劑顯色(se) 20min 後(hou)，酶標儀(yi)上讀取(qu) A405 吸收(shou)值(zhi)。
 

　　50mM 的(de)碳酸(suan)鹽(yan)包被(bei)緩(huan)沖液： 0.05mol/L pH9.6 碳酸(suan)緩(huan)沖液,4℃,保存(cun), Na2CO3 0.15 克(ke), NaHCO3  0.293 克(ke),蒸(zheng)餾水稀(xi)釋(shi)至(zhi) 100 ml。
 

　　ABTS 作為(wei)底物(wu)進(jin)行(xing)顯(xian)色(se)反應(ying)(10ml)：
 

　　1)、0.2M Na2HPO4 2.4ml
 

　　2)、0.1M    檸(ning)檬酸(suan) 2.6ml
 

　　3)、ddH2O  5ml
 

　　4)、ABTS 5mg
 

　　5)、H2O2(30%)    4 ul(用前(qian)加入)
 

　　註(zhu) 意：
 

　　1、壹(yi)般(ban)做倍比稀(xi)釋(shi)進(jin)行(xing)檢測(ce)，需要有(you)相(xiang)應的(de)對(dui)照(zhao)血(xue)清(qing)。
 

　　2、不(bu)同(tong)的(de)顯色(se)系統(tong)對(dui)應(ying)不同(tong)的(de)光吸(xi)收值(zhi)。