逆轉(zhuan)錄(lu)（reverse transcription）實驗作為(wei)是(shi)常見的(de)分(fen)子(zi)生(sheng)物(wu)學實驗之(zhi)壹(yi)，逆轉(zhuan)錄(lu)是(shi)以 RNA 為(wei)模(mo)板合(he)成(cheng) DNA 的(de)過程，即 RNA 指導(dao)下的(de) DNA 合成，逆轉(zhuan)錄(lu)實驗包括3大要素(su)，分(fen)別(bie)是(shi)引(yin)物、逆轉(zhuan)錄(lu)酶(mei)和 RNA 模(mo)板：
1. 引(yin)物：逆轉(zhuan)錄(lu)引(yin)物主(zhu)要有(you)3種(zhong)，包括 Oligo(dT)、Random Primers 和基(ji)因(yin)特異(yi)性(xing)引(yin)物(GSP)。其中(zhong) Oligo(dT)具(ju)有(you)12-20個(ge) T 堿(jian)基(ji)，並(bing)且與(yu)真(zhen)核生(sheng)物(wu) mRNA 的(de) 3’Poly A 尾(wei)配(pei)對，可(ke)合成(cheng)全長(chang)的(de) cDNA，但僅擴(kuo)增有 polyA 尾(wei)的(de) mRNA ，對模(mo)板質(zhi)量(liang)要(yao)求高(gao)，較(jiao)適(shi)合(he)克隆實驗。而 Random Primers 具有6-9個(ge)堿(jian)基(ji)，可(ke)隨機(ji)識(shi)別(bie)模(mo)板並(bing)結(jie)合(he)，適(shi)合(he)復雜結構(gou)和微(wei)量(liang)模(mo)板，但特異(yi)性(xing)低(di)，小(xiao)片段多(duo)，適合(he)後續 qPCR 實驗。基因特異(yi)性(xing)引(yin)物可(ke)以識別(bie)特定模(mo)板序(xu)列(lie)，具有特(te)異(yi)性(xing)強，靈(ling)敏(min)度(du)高(gao)的(de)特點，但需合(he)成特定(ding)的(de)序(xu)列(lie)。所(suo)以根據(ju)不(bu)同(tong)實驗需求可(ke)進(jin)行(xing)相應引(yin)物的(de)選擇。
2. 逆轉(zhuan)錄(lu)酶(mei)：壹種是(shi)來自純(chun)化的(de)禽成髓(sui)細胞(bao)瘤病毒(AMV)，由兩條肽(tai)鏈(lian)組成，具(ju)有(you)聚合酶(mei)活性(xing)和很(hen)強的(de) RNaseH 活性(xing)，它最適(shi)溫度(du)是(shi)42℃，最適(shi) pH8.3，在(zai)高(gao)反(fan)應溫度(du)時(shi)可(ke)消除(chu) mRNA 的(de)二(er)級結(jie)構(gou)對逆轉(zhuan)錄(lu)的(de)阻礙，然(ran)而(er)高(gao)水(shui)平的(de) RNaseH 的(de)活性(xing)既抑(yi)制(zhi) cDNA 產生(sheng)也限(xian)制(zhi)其長(chang)度(du)。另壹種(zhong)來(lai)源(yuan)於鼠(shu)白血病病(bing)毒(M-MLV)，是(shi)單肽鏈(lian)的(de)，有 RNA 聚合酶(mei)活性(xing)和相對較弱(ruo)的(de) RNaseH 活性(xing)，最適(shi)溫度(du)37℃，最適(shi) pH7.6，較(jiao)弱(ruo)的(de) RNaseH 活性(xing)對獲(huo)得(de)2-3kb的(de) mRNA 的(de)全長(chang) cDNA 有(you)很大好(hao)處(chu)。
3. RNA 模(mo)板：通(tong)常利(li)用(yong)紫(zi)外分(fen)光(guang)光(guang)度(du)計(ji)檢測純度(du)，要求A260/280=1.9~2.1，A260/230=2.0~2.2。利(li)用(yong)瓊(qiong)脂(zhi)糖凝膠(jiao)電(dian)泳檢測 RNA 的(de)完整度(du)，完整(zheng)的(de)總(zong) RNA 在(zai)進(jin)行(xing)瓊脂(zhi)糖凝膠(jiao)電(dian)泳時(shi)會(hui)產(chan)生(sheng)清(qing)晰的(de)28S 和18S rRNA 條帶(真(zhen)核樣(yang)品(pin))，28S rRNA 條帶的(de)強度(du)應當大致為(wei)18S rRNA 條帶的(de)兩倍(bei)，並且無 gDNA 和蛋白殘(can)留(liu)。
