熒光定(ding)量(liang)PCR(Real-time PCR)，是指在PCR擴(kuo)增(zeng)反應體系(xi)中(zhong)加(jia)入熒光基(ji)團(tuan)，通過(guo)對(dui)擴(kuo)增(zeng)反應中(zhong)每(mei)壹個循環(huan)產(chan)物熒光信號的(de)實時檢測(ce),最後(hou)通過(guo)標(biao)準(zhun)曲(qu)線(xian)對(dui)未(wei)知模(mo)板進行定量分析(xi)的(de)方(fang)法。
 

　　對(dui)照(zhao)的(de)目(mu)的(de)是(shi)對(dui)檢(jian)測(ce)的(de)各個環(huan)節進行監控(kong)，因(yin)此(ci)我(wo)們(men)按照(zhao)檢(jian)測(ce)的(de)流(liu)程(cheng)對(dui)對(dui)照(zhao)進行梳(shu)理(li)。
 

　　常規(gui)熒光定(ding)量(liang)PCR的(de)流(liu)程(cheng)是(shi)：樣品(pin)采集(ji)-運(yun)輸(shu)-樣品(pin)處(chu)理(li)-核(he)酸提取(qu)-反轉錄(lu)(RNA病毒(du))-擴(kuo)增(zeng)-結果(guo)讀取(qu)。下(xia)面看看各個環(huan)節都(dou)可(ke)以使用哪(na)些(xie)對(dui)照(zhao)？
 

　　1、陽(yang)性對(dui)照(zhao)和(he)陰性對(dui)照(zhao)
 

　　陽(yang)性對(dui)照(zhao)和(he)陰性對(dui)照(zhao)是(shi)指在(zai)相(xiang)同(tong)的(de)處(chu)理(li)條件(jian)下(xia)，比(bi)如(ru)壹份已(yi)知的(de)感(gan)染樣品(pin)和(he)壹份已(yi)知的(de)未(wei)感(gan)染樣品(pin)，都(dou)進行了(le)提取(qu)和(he)擴(kuo)增(zeng)最終獲(huo)得了(le)陽(yang)性結果(guo)和(he)陰性結果(guo)。陰陽(yang)性對(dui)照(zhao)強調(tiao)處(chu)理(li)過(guo)程(cheng)與(yu)樣品(pin)壹致，並(bing)且(qie)有明(ming)確的(de)預(yu)期(qi)結(jie)果(guo)。
 

　　2、擴(kuo)增(zeng)對(dui)照(zhao)
 

　　我(wo)們(men)通常(chang)說(shuo)的(de)陽(yang)性對(dui)照(zhao)和(he)陰性對(dui)照(zhao)指(zhi)的(de)是(shi)擴(kuo)增(zeng)試(shi)劑(ji)盒中(zhong)附(fu)帶(dai)的(de)不(bu)需要提取(qu)的(de)陽(yang)性對(dui)照(zhao)和(he)陰性對(dui)照(zhao)，更(geng)準(zhun)確(que)的(de)定(ding)義(yi)應該是(shi)擴(kuo)增(zeng)陽(yang)性對(dui)照(zhao)和(he)擴(kuo)增(zeng)陰性對(dui)照(zhao)。擴(kuo)增(zeng)陽(yang)性對(dui)照(zhao)含(han)有陽(yang)性擴(kuo)增(zeng)模板，擴(kuo)增(zeng)陰性對(dui)照(zhao)應含有陰性擴(kuo)增(zeng)模板(基質核(he)酸)。擴(kuo)增(zeng)對(dui)照(zhao)只(zhi)能監(jian)控(kong)每(mei)次擴(kuo)增(zeng)過(guo)程(cheng)中(zhong)的(de)擴(kuo)增(zeng)系(xi)統是(shi)否(fou)正(zheng)常，不(bu)能監(jian)控(kong)采樣、提取(qu)和(he)每(mei)份樣品(pin)的(de)操(cao)作(zuo)過(guo)程(cheng)。如(ru)果(guo)是檢測(ce)RNA樣品(pin)的(de)檢(jian)測(ce)試(shi)劑(ji)盒，其(qi)擴(kuo)增(zeng)陽(yang)性對(dui)照(zhao)使(shi)用質粒(li)，便無(wu)法監(jian)控(kong)反轉錄(lu)過(guo)程(cheng)。
 

　　3、內(nei)標(biao)(Internal Control，IC)
 

　　內(nei)標(biao)是(shi)指在同(tong)壹反應管中(zhong)與(yu)靶(ba)序列(lie)共(gong)同(tong)擴(kuo)增(zeng)的(de)壹段(duan)非靶序(xu)列(lie)分子(zi)。內(nei)標(biao)有兩種(zhong)形(xing)式，壹種(zhong)是(shi)使(shi)用天(tian)然(ran)樣品(pin)中(zhong)含有的(de)內(nei)參(can)基(ji)因(yin)作(zuo)為(wei)內標(biao)，另(ling)壹種(zhong)是(shi)人(ren)工添加(jia)的(de)內(nei)標(biao)。內(nei)標(biao)的(de)最(zui)大特點(dian)是(shi)與(yu)靶(ba)序列(lie)共(gong)同(tong)擴(kuo)增(zeng)，而(er)其(qi)他(ta)的(de)對(dui)照(zhao)都(dou)是獨(du)立(li)擴(kuo)增(zeng)。
 

　　3.1 內參(can)基(ji)因(yin)
 

　　通常(chang)它們(men)在各組(zu)織(zhi)和(he)細(xi)胞(bao)中(zhong)的(de)表(biao)達相(xiang)對(dui)恒(heng)定，在檢測(ce)基因(yin)的(de)表(biao)達水平變化時常用它來做參(can)照(zhao)物(wu)。內參(can)基(ji)因(yin)通常(chang)是持(chi)家基(ji)因(yin)(house-keeping gene)因(yin)為其(qi)表達水平受環(huan)境因(yin)素影響(xiang)較(jiao)小(xiao)，而(er)且(qie)在(zai)個(ge)體(ti)各個生(sheng)長(chang)階段(duan)的(de)幾乎全部(bu)組(zu)織(zhi)中(zhong)持(chi)續表達變化很(hen)小(xiao)。常(chang)用的(de)內(nei)參(can)基(ji)因(yin)包括(kuo)GAPDH、β-actin(BETA-actin)、18sRNA、B2M、HPRT和(he)TBP等。
 

　　內(nei)參基因(yin)的(de)優點(dian)是(shi)與(yu)樣品(pin)中(zhong)的(de)靶(ba)基(ji)因(yin)經歷(li)全相(xiang)同(tong)的(de)處(chu)理(li)程(cheng)序(xu)，可(ke)以監控(kong)采樣，運(yun)輸(shu)，核(he)酸提取(qu)和(he)擴(kuo)增(zeng)的(de)全部(bu)過(guo)程(cheng)。缺(que)點(dian)是(shi)不(bu)同(tong)物種(zhong)，不(bu)同(tong)生理(li)狀(zhuang)態下(xia)，不(bu)同(tong)組(zu)織(zhi)中(zhong)的(de)內(nei)參(can)基(ji)因(yin)存(cun)在(zai)壹定的(de)差(cha)異。如(ru)果樣品(pin)類型(xing)是口腔液，咽拭(shi)子(zi)等(deng)樣品(pin)，內(nei)參基因(yin)的(de)量(liang)很(hen)低可(ke)能(neng)導(dao)致實驗不(bu)成立(li)。如果(guo)檢(jian)測(ce)的(de)是(shi)環(huan)境樣品(pin)則(ze)內參基(ji)因(yin)可能(neng)全失效。
 

　　3.2人(ren)工(gong)內標(biao)
 

　　添加(jia)壹種(zhong)不(bu)會幹(gan)擾靶(ba)序列(lie)擴(kuo)增(zeng)的(de)人(ren)工(gong)合成(cheng)的(de)內(nei)標(biao)。現(xian)在國外(wai)的(de)診(zhen)斷(duan)試(shi)劑(ji)盒大部分都會(hui)將(jiang)內(nei)標(biao)直(zhi)接(jie)添加(jia)在反應液中(zhong)與(yu)模(mo)板壹起擴(kuo)增(zeng)，但(dan)是這(zhe)樣的(de)內(nei)標(biao)不(bu)能監(jian)控(kong)采樣，運(yun)輸(shu)和(he)核(he)酸提取(qu)的(de)過(guo)程(cheng)。
 

　　還(hai)有另(ling)壹種(zhong)形(xing)式的(de)內(nei)標(biao)，使(shi)用人工合成(cheng)的(de)假病(bing)毒(du)，在(zai)核(he)酸提取(qu)前在(zai)每(mei)壹份樣品(pin)中(zhong)加(jia)入等量(liang)的(de)內(nei)標(biao)，這(zhe)樣就(jiu)可以監控(kong)樣品(pin)的(de)提(ti)取(qu)到擴(kuo)增(zeng)的(de)過(guo)程(cheng)。但(dan)是由(you)於(yu)是人工(gong)添加(jia)到樣品(pin)中(zhong)，仍(reng)然(ran)不(bu)能監(jian)控(kong)胞內細(xi)菌(jun)病(bing)毒(du)的(de)釋(shi)放(fang)情(qing)況。
 

　　4、核(he)酸提取(qu)對(dui)照(zhao)
 

　　可(ke)以使用內參基因(yin)，假病(bing)毒(du)混(hun)合基(ji)質，滅(mie)活(huo)病(bing)毒(du)混合基(ji)質來(lai)監(jian)控(kong)提取(qu)到擴(kuo)增(zeng)的(de)流(liu)程(cheng)。
 

　　5、反轉錄(lu)對(dui)照(zhao)(RT control)
 

　　可(ke)以使用提取(qu)好的(de)RNA內(nei)參(can)基(ji)因(yin)，RNA假病(bing)毒(du)混(hun)合基(ji)質，滅(mie)活(huo)RNA病(bing)毒(du)混合基(ji)質來(lai)監(jian)控(kong)反轉錄(lu)到擴(kuo)增(zeng)的(de)流(liu)程(cheng)。
 

　　無(wu)反轉錄(lu)對(dui)照(zhao)(no-RT control)含(han)有除反轉錄(lu)酶(mei)以外的(de)所有成分。
 

　　6、空白對(dui)照(zhao)(Blank control)
 

　　6.1無(wu)模(mo)板空白對(dui)照(zhao)
 

　　NTC是(shi)指不(bu)含有模板(陽(yang)性模板或者陰性模板)的(de)對(dui)照(zhao)。目(mu)前的(de)試(shi)劑(ji)盒的(de)NC壹般都是(shi)水或陰性緩(huan)沖液，所以NC等同(tong)於(yu)NTC。其實兩者有不(bu)同(tong)的(de)作(zuo)用。
 

　　6.2儀(yi)器(qi)空白對(dui)照(zhao)
 

　　NTC是(shi)含有引物(wu)探針(zhen)和(he)反應液主(zhu)要監控(kong)引物探針(zhen)，反應體系(xi)有沒有被(bei)汙(wu)染。這裏(li)的(de)儀(yi)器(qi)空白對(dui)照(zhao)我(wo)通(tong)常使用的(de)是(shi)空反應管來(lai)監控(kong)儀(yi)器(qi)有無(wu)非特異(yi)性的(de)熒光信號。
 

　　6.3熒光染料(liao)對(dui)照(zhao)
 

　　最(zui)常使(shi)用的(de)是(shi)ROX染料(liao)，由於(yu)熒光定(ding)量(liang)PCR的(de)熒光信號在每(mei)個樣品(pin)孔會有微小(xiao)的(de)差(cha)異所以使用特定的(de)ROX熒光染料(liao)，系(xi)統可(ke)以根據ROX熒光染料(liao)的(de)信號值來校準(zhun)每(mei)孔的(de)熒光信號。
 

　　7、質控(kong)品(pin)(Quality control, QC)
 

　　上(shang)述(shu)環(huan)節中(zhong)使用的(de)各種(zhong)對(dui)照(zhao)大部分是試(shi)劑(ji)廠(chang)家匹配(pei)試(shi)劑(ji)盒使(shi)用的(de)產(chan)品(pin)，有的(de)是(shi)實驗室(shi)自制(zhi)，所以整(zheng)個的(de)監(jian)控(kong)過(guo)程(cheng)可(ke)能(neng)存(cun)在(zai)不(bu)夠客觀和(he)獨立(li)。因(yin)此(ci)在實驗室(shi)的(de)對(dui)照(zhao)設(she)置中(zhong)每(mei)次檢(jian)測(ce)都建議使(shi)用第三(san)方(fang)質控(kong)品(pin)，有條件(jian)的(de)使(shi)用國家有證標(biao)準(zhun)物質(Reference material ,RM)。由(you)於(yu)標(biao)準(zhun)物質具(ju)有準確(que)量值和(he)計(ji)量(liang)溯源(yuan)性，可以更(geng)準(zhun)確(que)的(de)評估整(zheng)個試(shi)驗(yan)流(liu)程(cheng)的(de)準(zhun)確(que)度(du)。
 

　　8、定(ding)值參考(kao)品(pin)
 

　　醫學上(shang)的(de)定(ding)量(liang)檢(jian)測(ce)試(shi)劑(ji)盒，需要配(pei)套定值參考(kao)品(pin)用於(yu)試(shi)劑(ji)盒的(de)定(ding)量(liang)檢(jian)測(ce)使用。
 

　　對(dui)照(zhao)的(de)選擇：
 

　　從(cong)上(shang)文可知(zhi)沒有壹種(zhong)對(dui)照(zhao)是(shi)美的(de)，在(zai)檢(jian)測(ce)中(zhong)我(wo)們(men)要根據自己的(de)需求來進行靈活選擇和(he)搭配(pei)。建議每(mei)壹次檢(jian)測(ce)時添加(jia)壹個能對(dui)從(cong)提取(qu)到擴(kuo)增(zeng)環(huan)節進行監控(kong)的(de)質控(kong)品(pin)或標(biao)準(zhun)物質；每(mei)份檢測(ce)樣品(pin)中(zhong)添加(jia)內標(biao)(如(ru)果樣品(pin)種(zhong)類比(bi)較(jiao)多(duo)樣建議使(shi)用人工內標(biao)，如(ru)果樣品(pin)類型(xing)為相(xiang)對(dui)固(gu)定(ding)的(de)動物組(zu)織(zhi)建議使(shi)用內參基因(yin))；擴(kuo)增(zeng)陽(yang)性對(dui)照(zhao)，擴(kuo)增(zeng)陰性對(dui)照(zhao)，無(wu)模(mo)板對(dui)照(zhao)和(he)ROX對(dui)照(zhao)。有條件(jian)的(de)添加(jia)臨(lin)床陽(yang)性對(dui)照(zhao)和(he)臨(lin)床陰性對(dui)照(zhao)，在(zai)懷(huai)疑(yi)提(ti)取(qu)環(huan)節或者反轉錄(lu)環(huan)節出(chu)現(xian)問題時使用核(he)酸提取(qu)對(dui)照(zhao)和(he)反轉錄(lu)對(dui)照(zhao)。不(bu)定期(qi)使用儀(yi)器(qi)空白對(dui)照(zhao)。