酶(mei)聯(lian)免疫(yi)吸(xi)附(fu)測定(ding)（Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay，ELISA）是(shi)免(mian)疫學(xue)和分子(zi)生物(wu)學(xue)中(zhong)廣泛(fan)使(shi)用的(de)實驗室(shi)技(ji)術， ELISA檢(jian)測(ce)是(shi)壹(yi)種(zhong)免疫(yi)檢(jian)測(ce)方(fang)法，通常(chang)用於(yu)測(ce)量生物(wu)樣(yang)品(pin)中(zhong)的(de)抗體或(huo)抗原，包(bao)括蛋(dan)白質(zhi)或糖蛋(dan)白。像(xiang)其他免(mian)疫(yi)檢(jian)測(ce)法壹(yi)樣(yang)，它(ta)們(men)依(yi)靠抗體與(yu)目標的結(jie)合(he)來促進(jin)檢(jian)測(ce)。

ELISA技(ji)術(shu)不同(tong)檢(jian)測(ce)方(fang)法具(ju)備以下共(gong)同操作(zuo)過程(cheng)：

1、板包(bao)被

大(da)多(duo)數ELISA檢(jian)測(ce)第(di)壹(yi)步(bu)是(shi)將(jiang)檢(jian)測(ce)的(de)第(di)壹(yi)個成(cheng)分與(yu)包被板結(jie)合(he)。這通常(chang)是(shi)通過被動(dong)吸附(fu)完成(cheng)的，壹(yi)個非(fei)特異(yi)性的(de)過程(cheng)，所(suo)以結(jie)果(guo)將(jiang)取(qu)決(jue)於(yu)塗在(zai)包被板上(shang)的(de)東西(xi)。

如(ru)果(guo)使(shi)用了(le)含有(you)抗原的(de)樣(yang)品(pin)，那就需要壹(yi)個具(ju)有(you)選(xuan)擇(ze)性的(de)包被板，因(yin)為各(ge)種(zhong)抗原都(dou)會結(jie)合(he)，而不僅僅是(shi)那(na)些(xie)感興趣(qu)的(de)。然(ran)而，如果(guo)像(xiang)用於(yu)抗體檢(jian)測(ce)的(de)ELISA間接(jie)法那樣(yang)使(shi)用純(chun)化(hua)抗原，或(huo)像ELISA夾心(xin)法那樣(yang)使(shi)用捕(bu)獲(huo)抗體，那(na)麽(me)我們(men)已(yi)經準備了壹(yi)個具(ju)有(you)選(xuan)擇(ze)性的(de)包被板。

包(bao)被板的(de)類(lei)型大(da)多(duo)數是(shi)[C8H8]n或(huo)[C8H8]n衍生物(wu)，其(qi)具(ju)有(you)不同(tong)的結(jie)合(he)特(te)性，這取決(jue)於(yu)目(mu)標物質和檢(jian)測(ce)的(de)性質(zhi)。壹(yi)些(xie)目標物質，包(bao)括重度(du)糖基化(hua)的蛋(dan)白質(zhi)、碳(tan)水(shui)化(hua)合物(wu)、DNA、脂(zhi)類(lei)、短肽和有(you)洗(xi)滌(di)劑的(de)蛋(dan)白質(zhi)，是(shi)不能(neng)很(hen)好(hao)吸附(fu)的。在(zai)這些(xie)情況下，建(jian)議使(shi)用經過處理(li)允(yun)許(xu)共(gong)價連接(jie)到(dao)表面(mian)的(de)包被板。

2、孵(fu)育(yu)

將(jiang)試劑加(jia)入ELISA板後，必須進(jin)行(xing)孵(fu)育(yu)，以便(bian)有(you)時(shi)間進(jin)行(xing)結(jie)合(he)或(huo)反(fan)應。每次孵(fu)育(yu)的(de)溫(wen)度(du)和時(shi)間將取(qu)決(jue)於(yu)檢(jian)測(ce)步(bu)驟(zhou)和正(zheng)在(zai)進(jin)行(xing)的操作(zuo)。通常(chang)在(zai)樣(yang)品(pin)應用之(zhi)後，與(yu)37℃下孵(fu)育(yu)1小(xiao)時(shi)。

然(ran)而，像阻(zu)斷這樣(yang)的(de)步(bu)驟(zhou)可(ke)以在(zai)冰(bing)箱中(zhong)過夜，測定(ding)過程(cheng)中(zhong)的(de)孵(fu)育(yu)通常(chang)在(zai)室(shi)溫(wen)下進(jin)行(xing)，時(shi)間短得(de)多。

3、洗(xi)滌(di)

洗(xi)板是(shi)在(zai)應用在(zai)檢(jian)測(ce)每(mei)個組成(cheng)部(bu)分之(zhi)間，直(zhi)到(dao)結(jie)果(guo)測(ce)定(ding)的壹(yi)個重(zhong)要步(bu)驟(zhou)。溶(rong)液從孔(kong)中(zhong)排(pai)空(kong)後，通常(chang)使用磷(lin)酸鹽緩沖鹽水-20（PBST）做為緩沖液清(qing)洗(xi)孔，以去(qu)除任(ren)何殘(can)留(liu)的(de)未結(jie)合(he)抗原、抗體或(huo)試劑。

這可(ke)以用多(duo)通道移(yi)液器(qi)手工(gong)完(wan)成(cheng)，或使(shi)用自動(dong)洗(xi)板機。

不充(chong)分的(de)清洗(xi)可(ke)能(neng)會(hui)導(dao)致高背景(jing)信(xin)號(hao)，而過多的清(qing)洗(xi)會導(dao)致樣(yang)品(pin)信(xin)號(hao)低(di)。不壹(yi)致的(de)清洗(xi)可(ke)能(neng)會(hui)導(dao)致整(zheng)個板塊(kuai)的(de)不壹(yi)致，從而導(dao)致不可(ke)靠的(de)結(jie)果(guo)。

4、阻(zu)斷

在(zai)用蛋(dan)白質(zhi)包被ELISA板後，阻(zu)斷通常(chang)是(shi)必要的，以防止(zhi)在(zai)接(jie)下來方案(an)步(bu)驟(zhou)中(zhong)測(ce)定(ding)抗體的(de)任(ren)何非(fei)特異(yi)性結(jie)合(he)。

與(yu)檢(jian)測(ce)無(wu)關(guan)的(de)混(hun)合蛋(dan)白被添(tian)加(jia)到(dao)板中(zhong)並(bing)進(jin)行(xing)孵(fu)育(yu)，占(zhan)據(ju)任(ren)何可(ke)用的(de)非(fei)特異(yi)性結(jie)合(he)位(wei)點。常(chang)見的(de)蛋(dan)白質(zhi)阻(zu)斷緩沖液選(xuan)擇(ze)包(bao)括脫脂(zhi)幹乳、牛血(xue)清白蛋(dan)白（BSA）和酪(lao)蛋(dan)白。

另(ling)外，非離子(zi)洗(xi)滌(di)劑，如(ru)Tween 20或(huo)Triton X-100，可(ke)作為阻(zu)斷劑使(shi)用，但(dan)不能(neng)像(xiang)蛋(dan)白質(zhi)那樣(yang)提(ti)供(gong)永jiu性阻(zu)斷。無(wu)效(xiao)的(de)板塊(kuai)阻(zu)斷會(hui)導(dao)致背景(jing)噪音(yin)增加(jia)，降(jiang)低(di)檢(jian)測(ce)的(de)靈(ling)敏(min)度(du)和特(te)異性。

5、抗體

實驗性抗體是(shi)大(da)多(duo)數ELISAs的基石，選擇(ze)正(zheng)確(que)的(de)抗體至(zhi)關重要，特別(bie)是(shi)在(zai)使用多(duo)種(zhong)抗體的(de)情況下。單克(ke)隆抗體和多(duo)克隆抗體都(dou)可(ke)以使(shi)用，它(ta)們(men)都(dou)有(you)各(ge)自的(de)有(you)點和缺點。單克(ke)隆抗體提(ti)供(gong)高特(te)異性，但(dan)成(cheng)本較(jiao)高。另(ling)壹(yi)方(fang)面(mian)，多克隆抗體可(ke)以在(zai)多個結(jie)合(he)點與目(mu)標結(jie)合(he)，放(fang)大(da)信(xin)號(hao)並(bing)提(ti)高靈(ling)敏(min)度(du)。

使(shi)用采(cai)用二(er)級(ji)抗體的(de)方法增加(jia)了(le)額(e)外(wai)的(de)步(bu)驟(zhou)，延(yan)長(chang)了檢(jian)測(ce)時(shi)間，增加(jia)了(le)出(chu)錯(cuo)機會(hui)，需要更多優(you)化(hua)來找(zhao)到合(he)適(shi)的(de)兼容(rong)抗體對(dui)。然(ran)而，使用多(duo)克(ke)隆二(er)級(ji)抗體所(suo)帶來的靈(ling)敏(min)度(du)提(ti)高可(ke)能(neng)使(shi)其(qi)成(cheng)為壹(yi)種(zhong)值(zhi)得(de)或必須的(de)有(you)效(xiao)檢(jian)測(ce)方(fang)法發展(zhan)方向(xiang)。

6、測定(ding)

無(wu)論使(shi)用哪(na)種(zhong)ELISA類型，最後壹(yi)步(bu)都是(shi)測(ce)定(ding)步(bu)驟(zhou)，最(zui)常(chang)見的(de)是(shi)利(li)用酶(mei)介(jie)導(dao)的(de)可(ke)見顏(yan)色(se)變(bian)化(hua)化(hua)學反(fan)應，然後可(ke)以用紫(zi)外(wai)-可(ke)見分光(guang)光(guang)度(du)法測量。

酶(mei)結(jie)合(he)抗原或(huo)抗體被應用到(dao)測(ce)試孔(kong)中(zhong)，如(ru)果(guo)目(mu)標存在(zai)，它(ta)就(jiu)會(hui)與(yu)之(zhi)結(jie)合(he)。當(dang)酶(mei)的(de)適(shi)當(dang)底物(wu)被添(tian)加(jia)到(dao)包(bao)被板上(shang)時(shi)，它(ta)會(hui)引(yin)起顏(yan)色(se)變(bian)化(hua)，與孔(kong)內結(jie)合(he)的(de)目(mu)標物的數(shu)量(liang)成(cheng)正比(bi)。辣根過氧化(hua)物酶(mei)（HRP）是(shi)壹(yi)種(zhong)常(chang)用共(gong)軛物，壹(yi)般(ban)與(yu)底物3,3',5,5'-四(si)甲(jia)基(ji)C6H6胺(an)（TMB）合(he)作(zuo)使(shi)用。底(di)物(wu)在(zai)HRP的作(zuo)用下變(bian)成(cheng)藍色(se)，然(ran)後在(zai)加(jia)入硫酸溶(rong)液後變(bian)成(cheng)黃色(se)，停(ting)止(zhi)反(fan)應。

然後可(ke)以用酶(mei)標儀（在(zai)TMB加(jia)入終(zhong)止(zhi)液後，在(zai)450nm波段測定(ding)），這是(shi)壹(yi)種(zhong)紫外(wai)可(ke)見分光(guang)光(guang)度(du)計(ji)，來確(que)定(ding)每個孔(kong)的吸(xi)光(guang)度(du)值(zhi)，並(bing)根(gen)據檢(jian)測(ce)設(she)計(ji)進(jin)行(xing)校(xiao)正(zheng)和計(ji)算，如(ru)減去空(kong)白(bai)孔(kong)平(ping)均(jun)值(zhi)、技(ji)術(shu)重復平(ping)均(jun)值(zhi)或(huo)與(yu)標準比率計(ji)算。