實時熒(ying)光定(ding)量(liang)PCR技(ji)術(shu)，是(shi)指在(zai)PCR反(fan)應(ying)體系(xi)中加入(ru)熒光(guang)基團，利用熒光(guang)信號(hao)積累(lei)實時監測整(zheng)個(ge)PCR進(jin)程(cheng)，最(zui)後通過(guo)標(biao)準(zhun)曲(qu)線(xian)對(dui)未知(zhi)模(mo)板(ban)進(jin)行定(ding)量(liang)分(fen)析(xi)的(de)方法。PCR實驗(yan)是(shi)分子(zi)生物(wu)學(xue)中常(chang)見(jian)用的實(shi)驗(yan)之壹，在基因擴增(zeng)、核(he)酸檢(jian)測(ce)、基因檢(jian)測(ce)等方(fang)面(mian)廣(guang)泛應用。PCR實驗(yan)前的(de)準(zhun)備(bei):
在開始(shi)PCR實(shi)驗(yan)之前(qian)，必(bi)須(xu)準備(bei)好DNA模(mo)板(ban)（基因組(zu)DNA或(huo)逆(ni)轉錄(lu)制備(bei)的cDNA）、特(te)異性引(yin)物(wu)（自(zi)己(ji)設計(ji)或用軟(ruan)件設計(ji)），並(bing)選擇(ze)合適的商(shang)業(ye)酶（選擇(ze)符(fu)合您實驗(yan)目的(de)的(de)酶)

2、引物(wu)的特(te)異性影(ying)響 PCR 成功的概(gai)率，良(liang)好的引物設計(ji)對(dui) PCR 擴增(zeng)的(de)成功至關重要(yao)。當您開始(shi)設(she)計引物時，應(ying)仔細考(kao)慮(lv)以下幾個(ge)原(yuan)則(ze)：
①引物(wu)的(de)長(chang)度(du)。PCR引物壹般(ban)在(zai)18-22bp左右(you)。這(zhe)對(dui)於引(yin)物(wu)特異性和(he)在(zai)退(tui)火(huo)溫度(du)下的結(jie)合來(lai)說(shuo)是(shi)足夠長(chang)的。
②熔(rong)化溫度(du)(Tm)。Tm 定(ding)義(yi)為在(zai)此溫度(du)下，DNA 雙(shuang)鏈(lian)體的壹半將(jiang)解(jie)離成單鏈(lian) DNA。52-58C 範(fan)圍(wei)內(nei)的(de)引(yin)物(wu) Tm 是(shi)最(zui)佳的(de)。
③GC 含量(liang)。最(zui)佳 GC 含(han)量(liang)應(ying)為 40-60%。
④許(xu)多軟(ruan)件可用於引(yin)物(wu)設計，例如(ru)primer5和Oligo。這(zhe)些軟(ruan)件推(tui)薦(jian)的引物通常(chang)可(ke)以滿足(zu)我們的需(xu)求。