Western免(mian)疫(yi)印跡(ji)（Western Blot）是將蛋白質(zhi)轉(zhuan)移到膜(mo)上，然(ran)後(hou)利(li)用抗體(ti)進(jin)行檢(jian)測。對已知表達(da)蛋白，可用(yong)相應(ying)抗體(ti)作(zuo)為(wei)壹抗進(jin)行檢(jian)測，對新基因的(de)表(biao)達產物(wu)，可通(tong)過融合部(bu)分的抗體(ti)檢(jian)測。主要(yao)試劑:
1、 丙(bing)烯酰(xian)胺(an)和N，N’-亞甲(jia)雙(shuang)丙(bing)烯酰(xian)胺(an)，應(ying)以(yi)溫(wen)熱(以(yi)利(li)於(yu)溶(rong)解雙(shuang)丙(bing)稀(xi)酰胺(an))的(de)去離子(zi)水配(pei)制(zhi)含(han)有(you)29%(w/v)丙(bing)稀(xi)酰胺(an)和1%(w/v)N，N’-亞甲(jia)雙(shuang)丙(bing)烯酰(xian)胺(an)儲(chu)存(cun)液丙(bing)稀(xi)酰胺(an)29g，N，N-亞甲(jia)叉(cha)雙(shuang)丙(bing)稀(xi)酰胺(an)1g，加H2O至(zhi)100ml。)儲於(yu)棕色瓶，4℃避光(guang)保(bao)存(cun)。嚴格核(he)實(shi)PH不得(de)超過7.0，因可(ke)以(yi)發生(sheng)脫氨(an)基反應(ying)是(shi)光(guang)催(cui)化或(huo)堿(jian)催化的。使用(yong)期不(bu)得超過兩個月，隔(ge)幾個月須重新配(pei)制(zhi)。如有(you)沈(chen)澱(dian)，可以過濾。
2、 十(shi)二(er)烷基硫酸鈉(na)SDS溶(rong)液:10%(w/v)0.1gSDS，1mlH2O去離子(zi)水配(pei)制(zhi)，室溫(wen)保存(cun)。
3、 分(fen)離(li)膠緩沖液(ye):1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL混合，加水(shui)稀(xi)釋(shi)到100ml終體(ti)積(ji)。過濾後(hou)40C保(bao)存(cun)。
4、 濃(nong)縮膠(jiao)緩沖液(ye):0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris溶於(yu)40mlH2O中，用(yong)約(yue)48ml 1mol/L HCL調至(zhi)pH6.8加水(shui)稀(xi)釋(shi)到100ml終體(ti)積(ji)。過濾後(hou)40C保(bao)存(cun)。這(zhe)兩種緩(huan)沖液(ye)必須使用(yong)Tris堿(jian)制(zhi)備，再用HCL調節(jie)PH值，而不(bu)用(yong)Tris.CL。
5、 TEMED原(yuan)溶(rong)液(ye)N，N，N’N’四(si)甲(jia)基乙(yi)二(er)胺(an)催(cui)化(hua)過硫酸銨(an)形(xing)成自(zi)由(you)基而加速(su)兩種丙(bing)稀(xi)酰胺(an)的(de)聚合。PH太(tai)低(di)時，聚合反(fan)應(ying)受(shou)到抑制(zhi)。10%(w/v)過硫酸胺(an)溶(rong)液(ye)。提(ti)供兩種丙(bing)稀(xi)酰胺(an)聚合所(suo)必(bi)須的自(zi)由(you)基。去離子(zi)水配(pei)制(zhi)數ml，臨用前(qian)配(pei)制(zhi).
6、 SDS-PAGE加樣緩沖液(ye):pH6.8 0.5mol/L Tris緩沖液(ye)8ml，甘油(you)6.4ml，10%SDS 12.8ml，巰基乙(yi)醇(chun)3.2ml，0.05%溴酚藍1.6ml，H2O 32ml混勻(yun)備用。按1:1或(huo)1:2比例與(yu)蛋(dan)白質(zhi)樣品混合，在(zai)沸(fei)水(shui)終煮3min混勻(yun)後(hou)再上樣，壹般為(wei)20-25ul，總(zong)蛋(dan)白量100μg。
7、 Tris-甘an酸電(dian)泳緩(huan)沖液(ye):30.3gTris，188g甘an酸，10gSDS，用(yong)蒸餾(liu)水(shui)溶解至1000ml，得0.25mol/L Tris-1.92mol/L甘an酸電(dian)極(ji)緩沖液(ye)。臨用前(qian)稀(xi)釋(shi)10倍。
8、 轉(zhuan)移緩(huan)沖液(ye)：配(pei)制(zhi)1L轉(zhuan)移緩(huan)沖液(ye)，需稱(cheng)取2.9g甘an酸、5.8gTris堿(jian)、0.37g SDS，並(bing)加入(ru)200ml甲(jia)醇(chun)，加水(shui)至總(zong)量1L。
9、 麗(li)春(chun)紅(hong)染(ran)液(ye)儲(chu)存(cun)液：麗(li)春(chun)紅(hong)S 2g 三氯yi酸30g 磺(huang)基水楊(yang)酸 30g 加水(shui)至100ml 用(yong)時上述儲存(cun)液稀(xi)釋(shi)10倍即(ji)成麗(li)春(chun)紅(hong)S使用(yong)液(ye)。使用(yong)後(hou)應(ying)予(yu)以廢棄(qi)。
10、 脫脂奶(nai)粉5%(w/v)。
11、 NaN3 0.02% 疊(die)氮(dan)鈉(na)(有(you)毒(du)，戴手套操(cao)作)，溶(rong)於(yu)磷酸緩(huan)沖鹽(yan)溶液(ye)(PBS)。
12、 Tris緩(huan)沖鹽(yan)溶液(ye)(TBS):20mmol/LTris/HCL(pH7.5)，500mmol/LnaCl。
13、 Tween20(15)鼠(shu)抗人-MMP-9(16)鼠抗人-TIMP-1。
14、 過氧(yang)化物(wu)酶標(biao)記的第二(er)抗體(ti)。
15、 NBT(溶(rong)於(yu)70%二(er)甲(jia)基甲(jia)酰(xian)胺(an)，75mg/ml)。
16、 BCIP(溶(rong)於(yu)100%二(er)甲(jia)基甲(jia)酰(xian)胺(an)，50mg/ml)。
17、 100mmol/LTris-HCL(pH9.5)。
18、 100mmol/L NaCl。
19、 50mmol/LTris-HCL(pH7.5)，5mmol/L EDTA。