PCR擴(kuo)增產(chan)物平端連(lian)接(jie)法(fa)克(ke)隆實(shi)驗(yan)原理(li)：
平頭連(lian)接(jie)是將(jiang)制備好的平頭載(zai)體和(he)補平或削平的PCR產(chan)物直(zhi)接(jie)進(jin)行(xing)連(lian)接(jie)。載(zai)體(ti)可(ke)用(yong)EcoR V或Sma I切(qie)成平頭；PCR產(chan)物純化後(hou)，可(ke)以在(zai)22℃用(yong)DNA聚(ju)合酶I作用(yong)30min（利(li)用(yong)該酶所具有的(de)3’→5’外(wai)切(qie)酶活(huo)性和(he)5’→3’的聚(ju)合酶活(huo)性）。
如(ru)果要(yao)求(qiu)不(bu)高，PCR產(chan)物也可(ke)不(bu)加(jia)處理(li)。如(ru)果使(shi)用(yong)Stratagene公(gong)司的(de)pfu DNA聚(ju)合酶或New England Biolabs公(gong)司的(de)Vent DNA聚(ju)合酶，這兩(liang)種酶有5’→3’校(xiao)對(dui)能(neng)力(li)，擴(kuo)增出(chu)來的PCR產(chan)物已(yi)經是平頭，可(ke)以不(bu)作平端處理(li)。平端連(lian)接(jie)的(de)壹(yi)個顯(xian)而易見的(de)缺(que)陷是連接(jie)效(xiao)率(lv)低下(xia)，即使(shi)使(shi)用(yong)很(hen)高單(dan)位(wei)的(de)連(lian)接(jie)酶，或在反(fan)應體(ti)系(xi)中加(jia)入PEG 8000，也只(zhi)能(neng)很(hen)有(you)限地(di)提高效(xiao)率(lv)。
通(tong)常(chang)情況(kuang)下(xia)，PCR產(chan)物可(ke)直(zhi)接(jie)與(yu)平端載(zai)體DNA進(jin)行(xing)連(lian)接(jie)，但(dan)其(qi)連(lian)接(jie)效(xiao)率(lv)效(xiao)低。因(yin)為Taq DNA聚(ju)合酶具有非模板依(yi)賴(lai)性末端轉移(yi)酶活(huo)性，能(neng)在(zai)兩(liang)6條 DNA鏈(lian)的(de)3'末端加(jia)上壹(yi)個多余(yu)的堿(jian)基，使(shi)合成的PCR產(chan)物成為3'突(tu)出(chu)壹(yi)個堿(jian)基的DNA分子(zi)。
這(zhe)種DNA分子(zi)的(de)連接(jie)效(xiao)率(lv)很低(di)。由於(yu)PCR產(chan)物的效(xiao)率(lv)通(tong)過較(jiao)高(gao)，在(zai)采(cai)用(yong)大(da)量T4 DNA連(lian)接(jie)酶並配以5-10u T4 RNA連(lian)接(jie)酶時，可(ke)顯(xian)著(zhu)提高其連(lian)接(jie)效(xiao)率(lv)。
對(dui)於(yu)較(jiao)短PCR產(chan)物，用(yong)PUS19的(de)HincⅡ位(wei)點(dian)進(jin)行(xing)克(ke)隆，以X-gal和(he)IPTG篩選，常(chang)可(ke)得(de)到(dao)足量重(zhong)組子(zi)。另壹(yi)種(zhong)提高克隆效(xiao)率(lv)的途(tu)徑是先用(yong)Klenow大(da)片(pian)段(duan)或T4DNA聚(ju)合酶消去3'末端突出(chu)堿(jian)基將(jiang)PCR產(chan)物變成平端DNA，然(ran)後(hou)再用(yong)平端連(lian)接(jie)法(fa)克(ke)隆PCR產(chan)物。
