1. 變性：在第壹(yi)輪循(xun)環(huan)前(qian),在94℃下變性5-10min 非(fei)常(chang)重(zhong)要,它(ta)可(ke)使模板(ban)DNAwan全解鏈(lian),然後(hou)加(jia)入(ru)Taq DNA聚合酶(hot start),這(zhe)樣可(ke)減(jian)少聚合酶在低溫(wen)下仍有活性從而延(yan)伸(shen)非(fei)特(te)異性(xing)配(pei)對的(de)引物(wu)與模(mo)板(ban)復(fu)合物所造成的(de)錯誤(wu)。變性不wan全,往(wang)往(wang)使(shi)PCR 失(shi)敗(bai),因(yin)為(wei)未變性wan全的(de)DNA 雙鏈(lian)會(hui)很快(kuai)復(fu)性,減(jian)少DNA 產(chan)量.壹(yi)般變性溫(wen)度(du)與時間(jian)為(wei)94℃ 1min。在變性溫(wen)度(du)下,雙鏈(lian)DNA 解(jie)鏈(lian)只(zhi)需(xu)幾秒(miao)鐘(zhong)即(ji)可(ke)wan全,所耗(hao)時間(jian)主(zhu)要是為(wei)使反(fan)應(ying)體系wan全(quan)達(da)到適當(dang)的(de)溫(wen)度(du)。對(dui)於富(fu)含(han)GC 的(de)序(xu)列(lie),可(ke)適當提(ti)高變性溫(wen)度(du).但(dan)變性溫(wen)度(du)過高或(huo)時間(jian)過長(chang)都會(hui)導致(zhi)酶活性的(de)損失(shi)。

2. 退火：這(zhe)是PCR 的(de)壹(yi)個關(guan)鍵(jian)參(can)數。在理(li)想(xiang)狀(zhuang)態(tai)下，退火溫(wen)度(du)足夠低，以保證(zheng)引物同目(mu)的(de)序(xu)列(lie)有效(xiao)退火，同時還(hai)要足夠高，以減(jian)少非(fei)特(te)異性(xing)結(jie)合。合理(li)的(de)退火溫(wen)度(du)從(cong)55℃到70℃。退火溫(wen)度(du)壹(yi)般設(she)定(ding)比引(yin)物(wu)的(de)Tm 低5℃, 當(dang)產(chan)物中(zhong)包含(han)有影(ying)響實(shi)驗的(de)非(fei)可(ke)異性(xing)擴增帶(dai)時,以2℃為(wei)增量，逐(zhu)步(bu)提(ti)高退火溫(wen)度(du)。較(jiao)高的(de)退火溫(wen)度(du)會(hui)減(jian)少引(yin)物(wu)二(er)聚體(ti)和非(fei)特(te)異性(xing)產(chan)物的(de)形(xing)成。如果兩(liang)個引(yin)物(wu)Tm 不同，將(jiang)退火溫(wen)度(du)設(she)定(ding)為(wei)比最di的(de)Tm 低5℃。或(huo)者(zhe)為(wei)了提(ti)高特(te)異性(xing)，可(ke)以在根(gen)據較高Tm 設計的(de)退火溫(wen)度(du)先(xian)進行5 個循(xun)環(huan)，然後(hou)在(zai)根據(ju)較低Tm 設(she)計(ji)的(de)退火溫(wen)度(du)進(jin)行剩(sheng)余的(de)循環(huan)。這(zhe)使得(de)在(zai)較(jiao)為(wei)嚴緊(jin)的(de)條件(jian)下可(ke)以獲得(de)目(mu)的(de)模板(ban)的(de)部分(fen)拷(kao)貝。退(tui)火溫(wen)度(du)越(yue)高,所得產物(wu)的(de)特(te)異性(xing)越(yue)高。有些反(fan)應(ying)甚至可(ke)將(jiang)退火與延(yan)伸(shen)兩(liang)步(bu)合並,只(zhi)用(yong)兩(liang)種(zhong)溫(wen)度(du)(例(li)如用60℃和94℃)完(wan)成整(zheng)個擴增循(xun)環(huan), 既省時間(jian)又(you)提(ti)高了特(te)異性(xing)。退(tui)火壹(yi)般僅(jin)需數(shu)秒(miao)鐘(zhong)即(ji)可(ke)完(wan)成,反應中(zhong)所(suo)需(xu)時間(jian)主(zhu)要是為(wei)使整(zheng)個反(fan)應(ying)體系達(da)到合適的(de)溫(wen)度(du)。

3. 延(yan)伸(shen)：延(yan)伸(shen)反(fan)應通常為(wei)72℃,接近於Taq DNA 聚合酶的(de)最適(shi)反應(ying)溫(wen)度(du)75℃.實(shi)際(ji)上(shang),引物(wu)延(yan)伸(shen)在(zai)退火時即(ji)已開始(shi),因(yin)為(wei)Taq DNA 聚合酶的(de)作用(yong)溫(wen)度(du)範圍(wei)可(ke)從20℃-85℃.延(yan)伸(shen)反(fan)應時間(jian)的(de)長短(duan)取決(jue)於(yu)目(mu)的(de)序(xu)列(lie)的(de)長度(du)和濃(nong)度(du).在壹(yi)般反(fan)應體(ti)系(xi)中(zhong),Taq DNA聚合酶每分(fen)鐘(zhong)約可(ke)合成1kb 長的(de)DNA。延(yan)伸(shen)時間(jian)過長(chang)會導致(zhi)產物非(fei)特(te)異性(xing)增(zeng)加.但對很低濃(nong)度(du)的(de)目(mu)的(de)序(xu)列(lie), 則(ze)可(ke)適當增(zeng)加延(yan)伸(shen)反(fan)應的(de)時間(jian)。壹(yi)般在(zai)擴增反(fan)應(ying)完(wan)成後,都需(xu)要(yao)壹(yi)步較(jiao)長時間(jian)(10-30min)的(de)延(yan)伸(shen)反(fan)應,以獲得(de)盡(jin)可(ke)能完(wan)整(zheng)的(de)產物(wu), 這(zhe)對以後進(jin)行克隆(long)或(huo)測(ce)序(xu)反(fan)應尤(you)為(wei)重(zhong)要。

4. 循環(huan)次數： 當(dang)其它(ta)參(can)數(shu)確(que)定(ding)之後(hou), 循(xun)環(huan)次數主(zhu)要取決(jue)於(yu)DNA 濃(nong)度。壹(yi)般而言25-30輪(lun)循環(huan)已經足夠。循(xun)環(huan)次數過多(duo),會(hui)使PCR 產物中(zhong)非(fei)特(te)異性(xing)產(chan)物大(da)量增(zeng)加(jia)。通常經25-30 輪(lun)循環(huan)擴增後(hou), 反(fan)應中Taq DNA 聚合酶已經不足, 如果此(ci)時產物量仍(reng)不夠, 需(xu)要(yao)進壹(yi)步擴增,可(ke)將(jiang)擴增的(de)DNA 樣品(pin)稀釋103-105倍(bei)作為(wei)模板(ban), 重(zhong)新(xin)加(jia)入(ru)各種(zhong)反應底(di)物(wu)進(jin)行(xing)擴增, 這(zhe)樣經60 輪(lun)循環(huan)後, 擴增水(shui)平可(ke)達(da)109-1010。擴增產(chan)物(wu)的(de)量還(hai)與擴增效(xiao)率有關(guan),擴增產(chan)物(wu)的(de)量可(ke)用下列公(gong)式(shi)表(biao)示(shi):C＝Co(1+P)n 。其中(zhong)：C 為(wei)擴增產(chan)物(wu)量,C0 為(wei)起始(shi)DNA 量, P 為(wei)增效(xiao)率, n 為(wei)循環(huan)次數。在(zai)擴增後(hou)期(qi),由(you)於(yu)產(chan)物(wu)積累(lei),使(shi)原來呈(cheng)指(zhi)數擴增的(de)反應(ying)變成平坦(tan)的(de)曲線(xian),產物(wu)不再隨循環(huan)數而明(ming)顯(xian)上(shang)升,這(zhe)稱為(wei)平臺(tai)效(xiao)應。平臺(tai)期(qi)會使(shi)原先(xian)由(you)於(yu)錯(cuo)配(pei)而產生(sheng)的(de)低濃(nong)度(du)非(fei)特(te)異性(xing)產(chan)物繼續(xu)大(da)量擴增，達(da)到較高水(shui)平。因(yin)此，應(ying)適(shi)當調(tiao)節(jie)循環(huan)次數，在(zai)平臺(tai)期(qi)前(qian)結(jie)束(shu)反(fan)應，減(jian)少非(fei)特(te)異性(xing)產(chan)物。