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          詳解(jie)PCR技術實(shi)驗原(yuan)理(li)
        2. 發布日期:2022-10-24      瀏(liu)覽(lan)次數:1458
          • 聚(ju)合(he)酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction,PCR)是壹項(xiang)利(li)用 DNA 雙鏈復制(zhi)原理(li),在(zai)生(sheng)物(wu)體外復制(zhi)特(te)定 DNA 片段的的核酸(suan)合(he)成技術。可(ke)在(zai)短時間(jian)內(nei)大量擴(kuo)增(zeng)目(mu)的 DNA 片段,而(er)不必(bi)依賴(lai)大腸(chang)桿(gan)菌或(huo)酵(jiao)母菌等生(sheng)物(wu)體。

            DNA 的半(ban)保留(liu)復制(zhi)是生(sheng)物(wu)進化和傳(chuan)代(dai)的重要途(tu)徑。雙鏈 DNA 在(zai)多(duo)種(zhong)酶的作用下(xia)可(ke)以(yi)變(bian)性(xing)解(jie)旋(xuan)成單(dan)鏈,在(zai) DNA 聚(ju)合(he)酶的參與(yu)下(xia),根據堿(jian)基(ji)互(hu)補(bu)配對原則(ze)復制(zhi)成同(tong)樣(yang)的兩分子拷貝(bei)。在(zai)實(shi)驗中(zhong)發現(xian),DNA 在(zai)高(gao)溫時也(ye)可(ke)以(yi)發生(sheng)變(bian)性(xing)解(jie)鏈,當溫度(du)降(jiang)低(di)後又(you)可以(yi)復性(xing)成為(wei)雙鏈。因(yin)此,通(tong)過溫度(du)變(bian)化(hua)控(kong)制(zhi) DNA 的變(bian)性(xing)和復性(xing),加入(ru)設(she)計引物(wu),DNA 聚合(he)酶,dNTP 就可(ke)以完(wan)成特(te)定基(ji)因(yin)的體外復制(zhi),這是 PCR 的理(li)論基(ji)礎(chu)。PCR技術的基(ji)本(ben)原理(li)類(lei)似於DNA的天(tian)然(ran)復制(zhi)過程,其(qi)特(te)異性(xing)依賴(lai)於與(yu)靶序(xu)列兩端(duan)互(hu)補(bu)的寡核(he)苷酸(suan)引物(wu)。

            PCR由變(bian)性(xing)--退火--延(yan)伸三(san)個(ge)基(ji)本(ben)反應步(bu)驟構成:
            1、模(mo)板DNA的變(bian)性(xing):模(mo)板DNA經(jing)加熱至94℃左(zuo)右(you)壹(yi)定時間(jian)後,使模板DNA雙鏈或經(jing)PCR擴(kuo)增(zeng)形(xing)成的雙鏈DNA解離,使之成為(wei)單(dan)鏈,以便它與(yu)引物(wu)結(jie)合(he),為(wei)下(xia)輪(lun)反(fan)應(ying)做準(zhun)備;

            2、模(mo)板DNA與(yu)引物(wu)的退火(復性(xing)):模板DNA經(jing)加熱變(bian)性(xing)成單(dan)鏈後,溫度(du)降(jiang)至55℃左(zuo)右(you),引物(wu)與(yu)模(mo)板DNA單(dan)鏈的互(hu)補(bu)序列配(pei)對結(jie)合(he);
             3、引物(wu)的延(yan)伸:DNA模板--引物(wu)結(jie)合(he)物(wu)在(zai)Taq酶的作用下(xia),以(yi)dNTP為(wei)反(fan)應(ying)原(yuan)料(liao),靶序(xu)列為(wei)模(mo)板,按(an)堿基(ji)配對與(yu)半(ban)保留(liu)復制(zhi)原理(li),合(he)成壹(yi)條(tiao)新(xin)的與(yu)模(mo)板DNA 鏈互(hu)補(bu)的半(ban)保留(liu)復制(zhi)鏈。

                重復循(xun)環變(bian)性(xing)--退火--延(yan)伸三(san)過程,就可(ke)獲得(de)更多(duo)的“半(ban)保留(liu)復制(zhi)鏈",而(er)且這種(zhong)新(xin)鏈又(you)可成為(wei)下(xia)次循環的模板。每(mei)完(wan)成壹(yi)個(ge)循環需(xu)2~4分鐘(zhong), 2~3小(xiao)時就能將(jiang)待擴(kuo)目(mu)的基(ji)因(yin)擴(kuo)增(zeng)放(fang)大幾(ji)百(bai)萬(wan)倍(bei)


               



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