ELISA試劑(ji)盒(he)實驗過程中常(chang)見問(wen)題(ti)剖析

　　1.標(biao)曲和樣(yang)本均不顯(xian)色

　　在(zai)孵育階(jie)段(duan)靜(jing)置在(zai)桌面上(shang)，這(zhe)樣(yang)非常(chang)不利(li)於抗(kang)原(yuan)抗(kang)體之間的(de)充(chong)沛接(jie)觸，導(dao)致顯(xian)色偏(pian)弱(ruo)。

　　孵育階(jie)段(duan)，運(yun)用(yong)ELISA的(de)微(wei)孔(kong)板振(zhen)蕩(dang)器，調(tiao)至(zhi)適(shi)宜(yi)的(de)頻(pin)率，使(shi)抗(kang)原(yuan)抗(kang)體充沛接(jie)觸，保證結合(he)作(zuo)用(yong)。假如排(pai)除(chu)上(shang)述(shu)原(yuan)因(yin)，有可能是漏加(jia)了(le)某個(ge)組(zu)分，如檢測抗(kang)體、酶(mei)等。關(guan)於比(bi)較大(da)意(yi)的(de)新手，必(bi)定要(yao)做(zuo)好符號(hao)和(he)記錄(lu)，或(huo)者運(yun)用(yong)增(zeng)加(jia)染(ran)料(liao)的(de)ELISA試(shi)劑盒。
 

　　2.標曲不顯(xian)色或(huo)顯(xian)色很弱(ruo)，樣(yang)本顯(xian)色

　　溶解規(gui)範品(pin)以(yi)及(ji)倍比(bi)稀釋(shi)時，未渦(wo)旋(xuan)震(zhen)動或(huo)不行充(chong)沛。

　　規(gui)範品(pin)溶解、倍比(bi)稀釋(shi)時均需求(qiu)渦(wo)旋(xuan)震(zhen)動以(yi)保證充(chong)沛混(hun)勻(yun)。單純(chun)移(yi)液器(qi)重(zhong)復吹打，效(xiao)率較低、作(zuo)用(yong)也(ye)不必(bi)定jia。
 

　　3.標(biao)曲顯(xian)色，樣(yang)本不顯(xian)色

　　當樣(yang)本中意(yi)圖(tu)蛋白濃(nong)度極(ji)低或(huo)者樣(yang)本中攪(jiao)擾(rao)要素較(jiao)強(qiang)，就無法(fa)檢(jian)測(ce)到(dao)。現(xian)在(zai)ELISA仍(reng)然(ran)是(shi)蛋(dan)白檢(jian)測(ce)活(huo)絡(luo)度gao的(de)辦(ban)法(fa)，與(yu)不同(tong)技(ji)能結合(he)後，衍生(sheng)出了(le)多(duo)種(zhong)類型的(de)ELISA，提(ti)高了(le)檢測活(huo)絡(luo)度。

　　關(guan)於意(yi)圖(tu)蛋白濃(nong)度特別(bie)低的(de)樣(yang)本，能夠嘗試用(yong)高敏(min)ELISA，但(dan)這(zhe)也(ye)並不意(yi)味(wei)著(zhe)必(bi)定能檢測到樣(yang)本濃(nong)度，只能說(shuo)能夠提高樣(yang)本的(de)可測(ce)率，並使(shi)成果愈(yu)加(jia)牢靠。因(yin)為通常(chang)用(yong)壹(yi)般(ban)ELISA檢(jian)測(ce)的(de)樣(yang)本OD值(zhi)都偏(pian)低，而(er)高敏(min)ELISA可提(ti)高樣(yang)本OD值(zhi)，使(shi)之盡(jin)量(liang)位於標(biao)曲範圍內，得(de)到(dao)的(de)數(shu)值(zhi)也(ye)愈加(jia)可信。
 

　　4.本底偏(pian)高，樣(yang)本值(zhi)測不到標(biao)曲的(de)本底即(ji)Blank孔(kong)的(de)OD值(zhi)壹(yi)般(ban)要(yao)求(qiu)控(kong)制(zhi)在(zai)0.1以(yi)下(xia)(關於高敏(min)ELISA能夠恰當放寬要求(qiu))。尤(you)其是樣(yang)本值(zhi)特別(bie)低的(de)時(shi)分，本底過(guo)高會掩(yan)蓋意(yi)圖(tu)信號，導(dao)致無法(fa)測(ce)到(dao)樣(yang)本值(zhi)。

　　在(zai)參加(jia)TMB顯(xian)色後，需實時(shi)觀察標(biao)曲顯(xian)se狀況。通(tong)常(chang)在(zai)S5孔(kong)有肉眼可見(jian)的(de)微(wei)弱(ruo)藍(lan)色(se)，即可停止反應(ying)。
 

　　5.標曲和樣(yang)本都顯(xian)色，但復孔(kong)的(de)CV大(da)

　　這(zhe)個(ge)問(wen)題(ti)就(jiu)跟(gen)移液器(qi)和(he)試(shi)驗者(zhe)的(de)操作(zuo)有關(guan)了(le)。移液器(qi)的(de)運(yun)用(yong)維(wei)護不規(gui)範，就會造(zao)成移液的(de)誤差較(jiao)大(da)；試驗(yan)者(zhe)自(zi)身(shen)的(de)操作(zuo)習慣(guan)、加(jia)樣(yang)的(de)壹(yi)致性(xing)對(dui)復孔(kong)的(de)CV也(ye)有很(hen)大(da)影(ying)響(xiang)。

　　掌握(wo)移(yi)液器(qi)的(de)正(zheng)確(que)運(yun)用(yong)和(he)維(wei)護。關(guan)於個(ge)人(ren)的(de)操作(zuo)可操練移(yi)液動(dong)作(zuo)、加(jia)快速度(du)，保證移(yi)液的(de)精密(mi)度(du)。
 

　　6.不同(tong)試劑(ji)盒(he)中(zhong)的(de)組(zu)分能否通用(yong)

　　除(chu)非是共(gong)用(yong)的(de)試(shi)劑如洗液、檢(jian)測(ce)緩(huan)沖(chong)液，其它組(zu)分不建(jian)議用(yong)其它試(shi)劑(ji)盒的(de)組(zu)分，乃至是(shi)同(tong)壹(yi)指(zhi)標不同(tong)批次的(de)試(shi)劑盒裏的(de)組(zu)分。這(zhe)些(xie)組分(包含規(gui)範品(pin)、規(gui)範品(pin)稀(xi)釋(shi)液、檢(jian)測(ce)抗(kang)體、酶(mei)等)都(dou)是經過優化(hua)的(de)，假如輕率運(yun)用(yong)其它試(shi)劑(ji)盒的(de)組(zu)分，有可能對成果產(chan)生(sheng)影(ying)響(xiang)。
 

　　7.樣(yang)本經不同(tong)梯(ti)度稀(xi)釋，核(he)算(suan)得(de)到(dao)的(de)樣(yang)本值(zhi)差異較大(da)

　　有時(shi)分咱(zan)們不清楚(chu)樣(yang)本中意(yi)圖(tu)蛋白的(de)濃(nong)度怎麽(me)，應(ying)該怎(zen)麽(me)稀(xi)釋(shi)，那麽(me)咱(zan)們就(jiu)會做(zuo)下(xia)預試(shi)驗(yan)，確(que)認稀(xi)釋倍(bei)數(shu)。但是有時(shi)分同(tong)壹(yi)樣(yang)本做(zuo)了(le)幾個(ge)不同(tong)梯(ti)度稀(xi)釋後，核算(suan)得(de)到(dao)的(de)樣(yang)本值(zhi)之間差異較大(da)，應(ying)該挑(tiao)選哪(na)壹(yi)個(ge)稀(xi)釋(shi)倍(bei)數呢？

　　這(zhe)裏觸及到(dao)了(le)基質效(xiao)應(ying)。通常(chang)血清樣(yang)本加(jia)樣(yang)量(liang)較高時，血(xue)清中(zhong)的(de)各(ge)種(zhong)蛋白會抑制(zhi)抗(kang)原(yuan)抗(kang)體的(de)接(jie)觸，基質效(xiao)應(ying)較顯(xian)著(zhe)。而(er)經(jing)過稀釋後，攪(jiao)擾(rao)要素也(ye)隨之稀釋，影(ying)響(xiang)就會較(jiao)小。當某(mou)兩(liang)個(ge)梯(ti)度稀(xi)釋後，核算(suan)得(de)到(dao)的(de)樣(yang)本值(zhi)挨近時，咱(zan)們就(jiu)能夠以(yi)為在(zai)該稀釋(shi)梯(ti)度時(shi)，樣(yang)本中的(de)攪(jiao)擾(rao)要素影(ying)響(xiang)較小，核(he)算(suan)得(de)到(dao)的(de)值(zhi)也(ye)是挨近真實的(de)。但(dan)是這(zhe)樣(yang)的(de)稀(xi)釋是針對(dui)意(yi)圖(tu)蛋白濃(nong)度較高的(de)樣(yang)本而(er)言(yan)。