大(da)鼠(shu)elisa試劑(ji)盒(he)實(shi)驗(yan)原(yuan)理：

  本(ben)大(da)鼠(shu)elisa試劑(ji)盒(he)應(ying)用(yong)雙(shuang)抗體(ti)夾(jia)心(xin)法(fa)測(ce)定標本(ben)中大(da)鼠(shu)TNF2α水平(ping)。用(yong)純(chun)化的大(da)鼠(shu)TNF2α抗(kang)體(ti)包(bao)被微(wei)孔(kong)板，制(zhi)成固相抗體(ti)，往包(bao)被單抗的微(wei)孔(kong)中依(yi)次(ci)加(jia)入(ru)TNF2α再(zai)與HRP標記(ji)的TNF2α抗體(ti)結(jie)合(he)，形(xing)成抗體(ti)-抗(kang)原(yuan)-酶標(biao)抗體(ti)復合(he)物，經過(guo)*洗滌(di)後(hou)加(jia)底(di)物TMB顯色。TMB在(zai)HRP酶(mei)的催(cui)化下(xia)轉(zhuan)化成藍色(se)，並(bing)在(zai)酸(suan)的作(zuo)用(yong)下(xia)轉化(hua)成*終的黃色(se)。顏色(se)的深淺(qian)和(he)樣品中的TNF2α呈(cheng)正相關。用(yong)酶(mei)標儀(yi)在(zai)450nm波長(chang)下(xia)測(ce)定(ding)吸光度(du)（OD值(zhi)），通(tong)過標準曲(qu)線(xian)計(ji)算樣品中大(da)鼠(shu)TNF2α濃(nong)度。

大(da)鼠(shu)elisa試劑(ji)盒(he)操(cao)作(zuo)步驟：

1. 標(biao)準品的稀(xi)釋與加(jia)樣：在(zai)酶(mei)標(biao)包(bao)被板上設標準(zhun)品孔(kong)10孔(kong)，在(zai)、第(di)二(er)孔(kong)中分(fen)別(bie)加(jia)標(biao)準(zhun)品(pin)100μl，然(ran)後在(zai)、第(di)二(er)孔(kong)中加(jia)標(biao)準(zhun)品(pin)稀(xi)釋液(ye)50μl，混(hun)勻；然(ran)後從孔(kong)、第二(er)孔(kong)中各(ge)取100μl分(fen)別(bie)加(jia)到(dao)第(di)三(san)孔(kong)和(he)第(di)四(si)孔(kong)，再(zai)在(zai)第(di)三(san)、第(di)四孔(kong)分(fen)別(bie)加(jia)標(biao)準(zhun)品(pin)稀(xi)釋液(ye)50μl，混(hun)勻；然(ran)後在(zai)第(di)三(san)孔(kong)和(he)第(di)四(si)孔(kong)中先(xian)各取50μl棄掉(diao)，再(zai)各(ge)取(qu)50μl分(fen)別(bie)加(jia)到(dao)第(di)五(wu)、第(di)六孔(kong)中，再(zai)在(zai)第(di)五(wu)、第(di)六孔(kong)中分(fen)別(bie)大(da)鼠(shu)elisa試劑(ji)盒(he)加(jia)標(biao)準(zhun)品(pin)稀(xi)釋液(ye)50ul，混(hun)勻；混(hun)勻後(hou)從第五(wu)、第六孔(kong)中各(ge)取50μl分(fen)別(bie)加(jia)到(dao)第(di)七、第八孔(kong)中，再(zai)在(zai)第(di)七、第八孔(kong)中分(fen)別(bie)加(jia)標(biao)準(zhun)品(pin)稀(xi)釋液(ye)50μl，混(hun)勻後(hou)從第七、第八孔(kong)中分(fen)別(bie)取(qu)50μl加(jia)到(dao)第(di)九(jiu)、第(di)十(shi)孔(kong)中，再(zai)在(zai)第(di)九(jiu)第(di)十(shi)孔(kong)分(fen)別(bie)加(jia)標(biao)準(zhun)品(pin)稀(xi)釋液(ye)50μl，混(hun)勻後(hou)從第九(jiu)第(di)十(shi)孔(kong)中各(ge)取50μl棄掉(diao)。（稀(xi)釋後(hou)各(ge)孔(kong)加(jia)樣量(liang)都為50μl，濃(nong)度分(fen)別(bie)為60ng/L，40ng/L ，20ng/L，10ng/L， 5ng/L）。

2. 加(jia)樣：分(fen)別(bie)設空(kong)白(bai)孔(kong)（空(kong)白(bai)對(dui)照(zhao)孔(kong)不(bu)加(jia)樣品及(ji)酶(mei)標試劑(ji)，其(qi)余(yu)各(ge)步操(cao)作(zuo)相同）、待(dai)測樣品孔(kong)。在(zai)酶(mei)標(biao)包(bao)被板上待(dai)測樣品孔(kong)中先(xian)加(jia)樣品稀(xi)釋液(ye)40μl，然(ran)後(hou)再(zai)加(jia)待(dai)測樣品10μl（樣品*終(zhong)稀(xi)釋度(du)為5倍(bei)）。加(jia)樣將樣品加(jia)於(yu)酶(mei)標板(ban)孔(kong)底部(bu)，盡量(liang)不(bu)觸(chu)及(ji)孔(kong)壁，輕(qing)輕(qing)晃(huang)動(dong)混(hun)勻。

3. 溫(wen)育：用(yong)封板膜(mo)封板後置37℃溫(wen)育30分(fen)鐘(zhong)。

4. 配液(ye)：將(jiang)30（48T的20倍(bei)）倍(bei)濃(nong)縮(suo)洗滌(di)液(ye)用(yong)蒸(zheng)餾水30（48T的20倍(bei)）倍(bei)稀(xi)釋後(hou)備(bei)用(yong)。

5. 洗滌(di)：小心(xin)揭掉(diao)封板膜(mo)，棄去(qu)液(ye)體(ti)，甩(shuai)幹(gan)，每孔(kong)加(jia)滿(man)洗滌(di)液(ye)，靜置(zhi)30秒後(hou)棄去(qu)，如此重(zhong)復5次(ci)，拍(pai)幹(gan)。

6. 加(jia)酶(mei)：每(mei)孔(kong)加(jia)入(ru)酶(mei)標(biao)試劑(ji)50μl，空(kong)白(bai)孔(kong)除(chu)外(wai)。

7. 溫(wen)育：操(cao)作(zuo)同3。

8. 洗滌(di)：操(cao)作(zuo)同5。

9. 顯色：每(mei)孔(kong)先加(jia)入(ru)顯色劑(ji)A50μl，再(zai)加(jia)入(ru)顯色劑(ji)B50μl，輕(qing)輕(qing)震(zhen)蕩混(hun)勻，37℃避(bi)光顯色15分(fen)鐘(zhong). 

10. 終止：每孔(kong)加(jia)終(zhong)止液(ye)50μl，終(zhong)止反(fan)應(ying)（此時(shi)藍色立(li)轉黃(huang)色）。

11. 測定：以(yi)空(kong)白(bai)空(kong)調零，450nm波長(chang)依(yi)序(xu)測(ce)量(liang)各孔(kong)的吸光度(du)（OD值(zhi)）。 測(ce)定應(ying)在(zai)加(jia)終(zhong)止液(ye)後(hou)15分(fen)鐘(zhong)以(yi)內(nei)進行。

大(da)鼠(shu)elisa試劑(ji)盒(he)樣本(ben)處(chu)理及(ji)要(yao)求(qiu)：

1. 血(xue)清：室溫(wen)血(xue)液(ye)自(zi)然(ran)凝(ning)固(gu)10-20分(fen)鐘(zhong)，離心20分(fen)鐘(zhong)左(zuo)右(you)（2000-3000轉(zhuan)/分(fen)）。仔細收(shou)集(ji)上清(qing)，保(bao)存(cun)過程中如出現(xian)沈澱，應(ying)再(zai)次(ci)離(li)心。

2. 血(xue)漿：應(ying)根據(ju)標本(ben)的要求(qiu)選擇EDTA或檸檬(meng)酸鈉作(zuo)為抗凝(ning)劑(ji)，混(hun)合(he)10-20分(fen)鐘(zhong)後，離心(xin)20分(fen)鐘(zhong)左(zuo)右(you)（2000-3000轉(zhuan)/分(fen)）。仔細收(shou)集(ji)上清(qing)，保(bao)存(cun)過程中如有沈澱形(xing)成，應(ying)該再(zai)次(ci)離(li)心。

3. 尿液(ye)：用(yong)無(wu)菌(jun)管收集(ji)，離心(xin)20分(fen)鐘(zhong)左(zuo)右(you)（2000-3000轉(zhuan)/分(fen)）。仔細收(shou)集(ji)上清(qing)，保(bao)存(cun)過程中如有沈澱形(xing)成，應(ying)再(zai)次(ci)離(li)心。胸腹水、腦脊液(ye)參(can)照(zhao)實(shi)行。

4. 大(da)鼠(shu)elisa試劑(ji)盒(he)上清(qing)：檢測分(fen)泌性的成份(fen)時(shi)，用(yong)無(wu)菌(jun)管收集(ji)。離心(xin)20分(fen)鐘(zhong)左(zuo)右(you)（2000-3000轉(zhuan)/分(fen)）。仔細收(shou)集(ji)上清(qing)。檢測細胞內(nei)的成份(fen)時(shi)，用(yong)PBS（PH7.2-7.4）稀(xi)釋細胞懸液(ye)，細胞濃(nong)度達(da)到100萬(wan)/ml左(zuo)右(you)。通(tong)過(guo)反(fan)復凍(dong)融，以(yi)使細胞破壞並放(fang)出細胞內(nei)成份(fen)。離心(xin)20分(fen)鐘(zhong)左(zuo)右(you)（2000-3000轉(zhuan)/分(fen)）。仔細收(shou)集(ji)上清(qing)。保(bao)存(cun)過程中如有沈澱形(xing)成，應(ying)再(zai)次(ci)離(li)心。

5. 組織(zhi)標(biao)本(ben)：切(qie)割(ge)標本(ben)後(hou)，稱(cheng)取(qu)重(zhong)量(liang)。加(jia)入(ru)壹定(ding)量(liang)的PBS，PH7.4。用(yong)液(ye)氮(dan)迅(xun)速冷凍保(bao)存(cun)備用(yong)。標(biao)本(ben)融化後仍(reng)然(ran)保(bao)持2-8℃的溫(wen)度。加(jia)入(ru)壹定(ding)量(liang)的PBS（PH7.4），用(yong)手(shou)工(gong)或勻漿器將(jiang)標(biao)本(ben)勻漿充分(fen)。離(li)心(xin)20分(fen)鐘(zhong)左(zuo)右(you)（2000-3000轉(zhuan)/分(fen)）。仔細收(shou)集(ji)上清(qing)。分(fen)裝(zhuang)後壹份(fen)待(dai)檢測(ce)，其(qi)余(yu)冷凍備(bei)用(yong)。

6. 標(biao)本(ben)采(cai)集(ji)後盡(jin)早進行提取，提(ti)取(qu)按相關文獻進行，提取(qu)後應(ying)盡快(kuai)進行(xing)實驗(yan)。若不(bu)能(neng)馬(ma)上進(jin)行試驗(yan)，可將標(biao)本(ben)放(fang)於(yu)-20℃保(bao)存(cun)，但應(ying)避免(mian)反(fan)復凍(dong)融.

7. 不(bu)能(neng)檢(jian)測(ce)含(han)NaN3的樣品，因NaN3抑(yi)制(zhi)辣(la)根過(guo)氧化(hua)物酶(mei)的（HRP）活性。