PCR檢測(ce)是(shi)壹種(zhong)基於(yu)聚(ju)合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction）技術的(de)分子生物學(xue)檢測(ce)方(fang)法(fa)，主要用於(yu)擴(kuo)增(zeng)和(he)檢測(ce)特(te)定DNA或RNA序(xu)列。

壹、PCR檢測(ce)的(de)基本原理(li)

1、DNA擴(kuo)增技(ji)術(shu)：PCR通(tong)過(guo)模(mo)擬(ni)DNA自(zi)然復(fu)制(zhi)過(guo)程(cheng)，在體(ti)外對(dui)特(te)定DNA片(pian)段(duan)進行(xing)指(zhi)數(shu)級(ji)擴增(zeng)。核(he)心(xin)步驟(zhou)包括：

變性：高溫（93℃）使雙(shuang)鏈DNA解(jie)離(li)為單(dan)鏈。

退(tui)火：降(jiang)溫（58℃）使引(yin)物與(yu)單(dan)鏈DNA結(jie)合。

延伸：DNA聚(ju)合酶在72℃催化(hua)下(xia)合(he)成(cheng)新(xin)鏈。

2、循(xun)環(huan)重(zhong)復(fu)：上述(shu)步驟循(xun)環(huan)30-35次(ci)，目(mu)標(biao)DNA片(pian)段(duan)數(shu)量(liang)呈指(zhi)數(shu)增(zeng)長(chang)（2^n倍），實現(xian)微量(liang)樣本(ben)的(de)可檢測(ce)性。

二、PCR檢測(ce)的(de)標(biao)準(zhun)操作流(liu)程(cheng)

1、反應體系配置(zhi)：

l 在無菌離心(xin)管中(zhong)混合(he)：10×PCR緩沖(chong)液（5μl）、dNTP混合(he)液（4μl）、引(yin)物1和(he)引(yin)物2（各(ge)2μl）、Taq酶（1μl）、DNA模(mo)板(ban)（1μl）、無核酸酶水補(bu)足至(zhi)50μl。

l 若PCR儀無熱蓋，需(xu)添(tian)加石(shi)蠟(la)油防(fang)止(zhi)蒸發。

2、擴增(zeng)程(cheng)序(xu)：

l 預(yu)變性：93℃加熱(re)3-5分鐘。

l 循(xun)環(huan)階(jie)段(duan)：93℃變性40秒 → 58℃退(tui)火30秒(miao) → 72℃延伸60秒(miao)，重(zhong)復(fu)30-35次(ci)。

l 最(zui)終(zhong)延(yan)伸(shen)：72℃保溫(wen)7分鐘。

3、結果(guo)處理(li)：

l 產(chan)物置(zhi)於(yu)4℃短(duan)期保存(cun)或-20℃長(chang)期保存(cun)。

l 電(dian)泳(yong)檢測(ce)：若含石(shi)蠟(la)油需(xu)用氯(lv)仿(fang)抽提去(qu)除，取(qu)5-10μl樣本(ben)進行(xing)凝(ning)膠電(dian)泳(yong)。

三(san)、特(te)殊場景(jing)註(zhu)意(yi)事(shi)項(xiang)

1、菌液PCR操作

l 直接(jie)使用熱(re)解菌(jun)液（10μL LB培(pei)養基重(zhong)懸單(dan)菌落）作為模(mo)板(ban)。

l 加(jia)樣需(xu)在超(chao)凈(jing)臺(tai)內完(wan)成，避(bi)免雜菌汙染。

2、高GC含量(liang)模(mo)板(ban)擴(kuo)增

l 增(zeng)加DMSO至(zhi)5-10%（v/v）降低二級(ji)結(jie)構(gou)，使用熱(re)啟(qi)動酶（如HotStart Taq）。

l 提高預(yu)變性溫度(du)至(zhi)98℃，延長(chang)變性時間至(zhi)10分鐘。

PCR檢測(ce)作(zuo)為(wei)分子診(zhen)斷(duan)核心(xin)工具(ju)，其(qi)技術叠(die)代(dai)與(yu)規範(fan)化(hua)應用將(jiang)持(chi)續(xu)深(shen)化(hua)在(zai)傳(chuan)染病(bing)防控、腫(zhong)瘤(liu)診(zhen)療及(ji)寵(chong)物健(jian)康(kang)等領(ling)域(yu)的(de)價(jia)值，但需(xu)警(jing)惕技術(shu)濫用與(yu)數(shu)據安全風(feng)險(xian)。