內(nei)毒素ELISA檢(jian)測試(shi)劑盒是(shi)壹(yi)種用(yong)於(yu)體(ti)外定(ding)量檢(jian)測生物(wu)樣(yang)本中(zhong)內(nei)毒素（ET）濃度的工(gong)具(ju)，在(zai)科(ke)研和醫(yi)學(xue)診斷(duan)領域(yu)應(ying)用(yong)廣泛(fan)。該(gai)試(shi)劑盒多(duo)基(ji)於雙抗體(ti)夾心(xin)法(fa)或(huo)競(jing)爭(zheng)酶(mei)聯免(mian)疫(yi)吸附(fu)試(shi)驗(yan)技術(shu)。以雙抗體(ti)夾心(xin)法(fa)為(wei)例(li)，用(yong)純(chun)化(hua)的內(nei)毒素抗體(ti)包(bao)被(bei)微(wei)孔(kong)板(ban)制成(cheng)固(gu)相(xiang)抗(kang)體(ti)，往包(bao)被(bei)單(dan)抗的微(wei)孔(kong)中(zhong)依(yi)次加入內(nei)毒素，再與HRP標(biao)記(ji)的內(nei)毒素抗體(ti)結合，形(xing)成(cheng)抗(kang)體(ti)-抗原-酶(mei)標(biao)抗(kang)體(ti)復合物(wu)，經過(guo)徹(che)d洗(xi)滌(di)後加底物(wu)TMB顯(xian)色(se)。TMB在(zai)HRP酶(mei)的催(cui)化(hua)下(xia)轉(zhuan)化(hua)成藍(lan)色(se)，並在(zai)酸(suan)的作用(yong)下(xia)轉(zhuan)化(hua)成最(zui)終的黃(huang)色(se)。顏(yan)色(se)的深(shen)淺和樣品中的內(nei)毒素呈正相(xiang)關(guan)，用(yong)酶(mei)標(biao)儀(yi)在(zai)450nm波(bo)長下(xia)測定(ding)吸光(guang)度(du)（OD值(zhi)），通過(guo)標(biao)準曲線(xian)計算(suan)樣(yang)品中(zhong)內(nei)毒素濃度。
（1）加樣規範
樣本處(chu)理：
血清(qing)/血漿(jiang)需(xu)離心(xin)（≥3000 rpm，10分(fen)鐘(zhong)）去(qu)除(chu)雜(za)質，稀釋(shi)倍數(shu)參考說(shuo)明書(shu)。
避(bi)免(mian)反(fan)復凍(dong)融樣(yang)本，建議單(dan)次實(shi)驗(yan)分裝(zhuang)使用(yong)。
加樣順序：
標(biao)準品：按(an)濃度(du)從(cong)低(di)到(dao)高(gao)依(yi)次加樣，每孔100μL（具(ju)體(ti)體(ti)積以說明(ming)書(shu)為(wei)準）。
樣本：單(dan)孔(kong)或(huo)雙孔重(zhong)復，設(she)置(zhi)陰(yin)性/陽(yang)性對(dui)照(zhao)（如(ru)廠家(jia)提(ti)供(gong)）。
空白(bai)對(dui)照(zhao)：加入稀(xi)釋(shi)液替(ti)代樣本。
加樣技巧(qiao)：
緊貼孔壁加樣，避(bi)免(mian)滴(di)入孔(kong)底產生氣泡(pao)。
加樣後輕搖(yao)板(ban)架混(hun)勻(yun)，但避(bi)免(mian)劇(ju)烈(lie)晃動。
（2）孵(fu)育與(yu)洗(xi)滌(di)
孵育條(tiao)件：
37℃恒(heng)溫箱(xiang)孵(fu)育（時間通(tong)常(chang)30-60分鐘(zhong)），避(bi)免(mian)溫(wen)度波(bo)動。
若室溫過低(di)，需(xu)延長孵育時間或(huo)使(shi)用(yong)加熱(re)板(ban)。
洗(xi)板(ban)操(cao)作：
棄去孔(kong)內(nei)液體(ti)，每孔(kong)註入300-400μL洗(xi)液，靜置(zhi)5秒後(hou)拍(pai)幹（避(bi)免(mian)用(yong)力(li)過(guo)猛導(dao)致(zhi)微(wei)球(qiu)脫落）。
重(zhong)復洗(xi)板(ban)5次，最(zui)後(hou)在(zai)吸水(shui)紙(zhi)上扣幹殘(can)留液(ye)。
（3）顯(xian)色(se)與終(zhong)止
顯(xian)色(se)底物(wu)：
TMB（四(si)甲(jia)基(ji)聯(lian)苯(ben)胺）需(xu)避(bi)光(guang)保(bao)存(cun)，臨(lin)用(yong)前(qian)等(deng)體(ti)積混(hun)合A液(ye)和B液（如(ru)H₂O₂）。
每孔(kong)加100μL，室溫避(bi)光(guang)反(fan)應(ying)（通常(chang)10-15分鐘），觀(guan)察顏(yan)色(se)變化(hua)。
終止(zhi)反應(ying)：
及時加入終(zhong)止液（如(ru)2M H₂SO₄），每孔(kong)50μL，輕敲(qiao)板(ban)框混(hun)勻(yun)。
終(zhong)止(zhi)後(hou)立即(ji)檢(jian)測OD值(zhi)（延(yan)遲(chi)可能(neng)導(dao)致(zhi)讀(du)數(shu)偏差）。
