PCR（聚(ju)合酶(mei)鏈式(shi)反應）的(de)特(te)異(yi)性是指(zhi)在(zai)擴增(zeng)過程中，僅(jin)擴增(zeng)出(chu)所(suo)需(xu)的(de)特(te)定DNA序(xu)列而(er)沒(mei)有其(qi)他(ta)非(fei)特(te)異(yi)性產物的(de)能(neng)力。提(ti)高PCR反應的(de)特(te)異(yi)性對(dui)於(yu)確(que)保實驗結(jie)果(guo)的(de)準確(que)性和(he)可靠性至關重要。
PCR 反應特(te)異(yi)性提(ti)高(gao)的(de)五大(da)方法：
1. 引物(wu)的(de)設計(ji)
引物最(zui)好在模板 cDNA 的(de)保守區設計(ji)，長度(du) 15-30bp，GC 含量小於(yu) 60%，3’端(duan)不(bu)超(chao)過連(lian)續(xu)三個(ge) G 或(huo) C，堿(jian)基分(fen)
布(bu)錯(cuo)落(luo)有(you)致，避免引物自(zi)身(shen)形(xing)成二聚(ju)體，設(she)計完(wan)成之(zhi)後，需(xu)進(jin)行 BLAST 檢(jian)測(ce)，如果(guo)與(yu)其(qi)他(ta)基因不(bu)具(ju)有(you)互(hu)補(bu)性，則(ze)可以進(jin)行下壹步(bu)實驗。
2. 降落(luo) PCR
降(jiang)落(luo) PCR 是壹種簡單(dan)的(de)降低(di)非(fei)特(te)異(yi)性產物的(de) PCR，最大(da)的(de)優點(dian)就(jiu)是可以降(jiang)低實驗耗(hao)時(shi)，同(tong)時(shi)又可以優(you)化(hua)實驗的(de)步(bu)驟(zhou)。引物(wu)的(de)設計(ji)決定退火(huo)溫(wen)度(du)，退火(huo)溫(wen)度(du)過高會(hui)使(shi) PCR 效(xiao)率過低，過低則(ze)會(hui)使(shi)非(fei)特(te)異(yi)擴增(zeng)過多。這(zhe)雖然(ran)可以通(tong)過反復(fu)嘗(chang)試(shi)來(lai)優化(hua)，但費(fei)時(shi)費(fei)力。降(jiang)落(luo) PCR 提(ti)供(gong)了(le)壹(yi)個(ge)較為簡易(yi)的(de)優化(hua)方法。首(shou)先(xian)在(zai)較高的(de)溫度(du)下擴增(zeng)，此(ci)時(shi)雖然(ran)擴增(zeng)效(xiao)率低，但(dan)非(fei)特(te)異(yi)擴增(zeng)基本沒(mei)有。隨著(zhe)退火(huo)溫(wen)度(du)的(de)降低(di)，非(fei)特(te)異(yi)擴增(zeng)會(hui)逐(zhu)步(bu)增(zeng)多(duo)。但(dan)由於(yu)此時(shi)特(te)異(yi)的(de)擴增(zeng)產物已(yi)經達(da)到(dao)壹定的(de)數量優勢(shi)，因此(ci)會(hui)對(dui)非(fei)特(te)異(yi)擴增(zeng)產生強烈的(de)競爭抑制，從(cong)而(er)大(da)幅提(ti)高(gao) PCR 的(de)特(te)異(yi)性和(he)效(xiao)率。
3. 熱啟(qi)動擴增(zeng)
采(cai)用熱啟(qi)動方法進行擴增(zeng)，是除了(le)設(she)計(ji)最(zui)佳(jia)引物之(zhi)外(wai)，提高 PCR 反應特(te)異(yi)性好(hao)的(de)方式(shi)。在壹般的(de) PCR 反應中(zhong)，試(shi)劑(ji)的(de)配(pei)置(zhi)需(xu)在(zai)冰上進行，且(qie)要(yao)將(jiang) PCR 儀預(yu)熱，這種方法就(jiu)類似(si)於(yu)熱啟(qi)動，能(neng)夠(gou)壹(yi)定程度(du)的(de)抑制錯(cuo)配(pei)。但(dan)是酶在低溫(wen)下也存(cun)在(zai)活(huo)性，只(zhi)要(yao)體系(xi)中有 DNA 鏈存(cun)在(zai)，就(jiu)會擴增(zeng)產生非(fei)特(te)異(yi)性條(tiao)帶(dai)。采(cai)用熱啟(qi)動的(de)方法就(jiu)是在達(da)到(dao)變性溫(wen)度(du)之(zhi)前(qian)wan全(quan)抑制酶(mei)的(de)活性，而(er)zui有(you)效的(de)方法就(jiu)是使(shi)用(yong)熱啟(qi)動 Taq 酶(或(huo)熱啟(qi)動高保真聚(ju)合酶(mei))去(qu)擴增(zeng)，它的(de)原理就(jiu)是采(cai)用化(hua)學修飾的(de)方法封閉(bi)酶的(de)活性中(zhong)心，當(dang)溫度(du)上升(sheng)到(dao) 95℃時恢(hui)復(fu)活(huo)性，指(zhi)導(dao)擴增(zeng)。
4. 巢式(shi) PCR
采(cai)用巢式(shi) PCR 進行擴增(zeng)，在(zai)多(duo)輪(lun)擴增(zeng)結(jie)果(guo)中提高擴增(zeng)特(te)異(yi)性和(he)靈(ling)敏(min)度(du)。與(yu)普通 PCR 不(bu)同(tong)的(de)是，它采(cai)用兩(liang)對(dui)引(yin)物進行擴增(zeng)，首(shou)先(xian)用(yong)第(di)壹(yi)對(dui)引(yin)物普通 PCR，然(ran)後將(jiang)第壹(yi)輪擴增(zeng)的(de)產物稀釋(shi) 100 倍(bei)後用(yong)第二對(dui)引(yin)物(巢式(shi)引物)二次(ci)擴增(zeng)。因(yin)此(ci)采(cai)用巢式(shi) PCR 可以大(da)大增(zeng)加(jia)困難模(mo)板擴增(zeng)的(de)特(te)異(yi)性和(he)有(you)限(xian)靶(ba)序(xu)列的(de)靈(ling)敏(min)度(du)。
