巨噬細(xi)胞(bao)炎性(xing)蛋(dan)白3β試劑盒(he)說明(ming)書

實驗原理(li):

本試(shi)劑(ji)盒應用雙抗體夾(jia)心法測(ce)定標本(ben)中血(xue)清素/血(xue)清胺(ST)水(shui)平。用純化的(de)血清素/血清胺(ST)抗體包(bao)被微孔(kong)板(ban)，制成固(gu)相抗體，往(wang)包(bao)被單(dan)抗的(de)微孔(kong)中依(yi)次加入血清素/血清胺(ST)，再與HRP標(biao)記(ji)的(de)血清素/血清胺(ST)抗體結(jie)合，形成抗體-抗原-酶(mei)標(biao)抗體復(fu)合(he)物(wu)，經過(guo)徹di洗(xi)滌(di)後(hou)加底物(wu)TMB顯(xian)色(se)。TMB在(zai)HRP酶(mei)S的(de)催化下(xia)轉化成藍色(se)，並在(zai)酸(suan)的(de)作(zuo)用下(xia)轉化成最(zui)終(zhong)的(de)黃色(se)。顏(yan)色(se)的(de)深淺和(he)樣(yang)品(pin)中的(de)血清素/血清胺(ST)呈(cheng)正相關。用(yong)酶(mei)標(biao)儀在(zai)450nm波長下(xia)測(ce)定吸光度（OD值(zhi)），通過標(biao)準(zhun)曲(qu)線(xian)計算(suan)樣(yang)品(pin)中血清素/血清胺(ST)濃度。

試劑(ji)盒(he)組成 ：

1、30倍(bei)濃縮洗(xi)滌(di)液 20ml×1瓶(ping) 7 終(zhong)止液(ye) 6ml×1瓶(ping)

2、酶(mei)標試劑 6ml×1瓶(ping) 8 標(biao)準(zhun)品(pin)（160pg/ml） 0.5ml×1瓶(ping)

3、酶(mei)標(biao)包(bao)被板(ban) 12孔(kong)×8條 9 標(biao)準(zhun)品(pin)稀釋液(ye) 1.5ml×1瓶(ping)

4、樣(yang)品(pin)稀釋液(ye) 6ml×1瓶(ping) 10 說明書 1份(fen)

5、顯(xian)色(se)劑(ji)A液 6ml×1瓶(ping) 11 封板(ban)膜 2張  

6、顯(xian)色(se)劑(ji)B液 6ml×1/瓶(ping) 12 密封袋 1個

標(biao)本要求: 

1．標(biao)本(ben)采集後(hou)盡(jin)早進(jin)行(xing)提(ti)取，提(ti)取按相(xiang)關文獻(xian)進(jin)行(xing)，提(ti)取後(hou)應(ying)盡(jin)快(kuai)進(jin)行(xing)實驗。若(ruo)不能馬上(shang)進(jin)行(xing)試驗，可將(jiang)標(biao)本(ben)放於(yu)-20℃保存(cun)，但(dan)應(ying)避免(mian)反復凍融(rong)

2．不能檢(jian)測(ce)含(han)NaN3的(de)樣品(pin)，因NaN3抑制辣(la)根過(guo)氧化物(wu)酶(mei)的(de)（HRP）活(huo)性(xing)。

樣(yang)本處(chu)理(li)及(ji)要(yao)求：

1.血(xue)清：全血標本(ben)請於(yu)室(shi)溫(wen)放置(zhi)2小(xiao)時(shi)或(huo)4℃過(guo)夜(ye)後(hou)於(yu)1000g離心20分(fen)鐘(zhong)，取上(shang)清即可檢(jian)測(ce)，或將(jiang)標(biao)本(ben)放於(yu)-20℃或(huo)-80℃保存(cun)，但(dan)應(ying)避免(mian)反復凍融(rong)。

2.  血(xue)漿：可(ke)用(yong)EDTA或肝(gan)素作(zuo)為抗凝(ning)劑，標(biao)本(ben)采(cai)集後(hou)30分(fen)鐘(zhong)內(nei)於(yu)2 - 8°C 1000g離心20分(fen)鐘(zhong)，或將(jiang)標(biao)本(ben)放於(yu)-20℃或(huo)-80℃保存(cun)，但(dan)應(ying)避免(mian)反復凍融(rong)。

3.  組(zu)織勻(yun)漿：用(yong)預冷(leng)的(de)PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗(xi)組織，去除殘(can)留(liu)血(xue)液(ye)（勻(yun)漿中(zhong)裂(lie)解(jie)的(de)紅(hong)細(xi)胞(bao)會影(ying)響(xiang)測(ce)量結(jie)果），稱(cheng)重(zhong)後(hou)將(jiang)組(zu)織剪(jian)碎(sui)。將(jiang)剪(jian)碎(sui)的(de)組織與對(dui)應(ying)體(ti)積(ji)的(de)PBS（壹般按1:9的(de)重量(liang)體積(ji)比(bi)，比如(ru)1g的(de)組織樣品(pin)對(dui)應(ying)9mL的(de)PBS，具(ju)體體(ti)積(ji)可(ke)根據(ju)實驗(yan)需要(yao)適當調整(zheng)，並做好(hao)記(ji)錄(lu)。推(tui)薦在(zai)PBS中(zhong)加入蛋(dan)白酶抑制劑）加入玻璃勻(yun)漿器(qi)中(zhong)，於(yu)冰(bing)上充分(fen)研(yan)磨。為了(le)進(jin)壹步裂解(jie)組織細(xi)胞(bao)，可以對(dui)勻(yun)漿液(ye)進(jin)行(xing)超聲破(po)碎(sui)，或反復(fu)凍融(rong)。將(jiang)勻(yun)漿液(ye)於(yu)5000×g離心5~10分(fen)鐘(zhong)，取上(shang)清檢(jian)測(ce)。

4.  細(xi)胞(bao)培養物(wu)上(shang)清或其(qi)它(ta)生物(wu)標(biao)本(ben)：1000g離心20分(fen)鐘(zhong)，取上(shang)清即可檢(jian)測(ce)，或將(jiang)標(biao)本(ben)放於(yu)-20℃或(huo)-80℃保存(cun)，但(dan)應(ying)避免(mian)反復凍融(rong)。

操作(zuo)步驟：

1. 標準(zhun)品(pin)的(de)稀釋：本(ben)試(shi)劑盒(he)提(ti)供原(yuan)倍(bei)標(biao)準(zhun)品(pin)壹支(zhi)，用戶(hu)可(ke)按照(zhao)下(xia)列圖(tu)表在(zai)小(xiao)試管(guan)中進(jin)行(xing)稀釋。

2. 加樣：分(fen)別(bie)設空(kong)白孔（空(kong)白對(dui)照(zhao)孔不加樣品(pin)及(ji)酶(mei)標(biao)試劑，其(qi)余(yu)各(ge)步操作(zuo)相同）、標(biao)準(zhun)孔(kong)、待(dai)測(ce)樣品(pin)孔。在(zai)酶(mei)標包(bao)被板(ban)上標準(zhun)品(pin)準(zhun)確加樣50μl，待(dai)測(ce)樣品(pin)孔中先(xian)加樣品(pin)稀釋液(ye)40μl，然(ran)後(hou)再加待測(ce)樣品(pin)10μl（樣品(pin)最(zui)終(zhong)稀釋度為(wei)5倍(bei)）。加樣將(jiang)樣(yang)品(pin)加於(yu)酶(mei)標板(ban)孔底部，盡(jin)量不觸(chu)及(ji)孔(kong)壁(bi)，輕輕晃(huang)動混(hun)勻(yun)。

3. 溫(wen)育(yu)：用(yong)封板(ban)膜封板(ban)後(hou)置(zhi)37℃溫(wen)育(yu)30分(fen)鐘(zhong)。   

4. 配(pei)液：將(jiang)30倍(bei)濃縮洗(xi)滌(di)液用蒸(zheng)餾水(shui)30倍(bei)稀釋後(hou)備用

5. 洗(xi)滌(di)：小心揭掉封板(ban)膜，棄(qi)去液體，甩幹(gan)，每(mei)孔(kong)加滿洗(xi)滌(di)液，靜置(zhi)30秒後(hou)棄(qi)去，如(ru)此(ci)重復5次，拍(pai)幹(gan)。

6. 加酶：每(mei)孔(kong)加入酶標試劑(ji)50μl，空(kong)白孔除外(wai)。

7. 溫(wen)育(yu)：操作(zuo)同3。

8. 洗(xi)滌(di)：操作(zuo)同5。

9. 顯(xian)色(se)：每(mei)孔(kong)先(xian)加入顯(xian)色(se)劑(ji)A50μl，再加入顯(xian)色(se)劑(ji)B50μl，輕(qing)輕震(zhen)蕩混(hun)勻(yun)，37℃避光(guang)顯(xian)色(se)10分(fen)鐘(zhong).

10. 終(zhong)止：每(mei)孔(kong)加終(zhong)止液(ye)50μl，終(zhong)止反(fan)應(ying)（此時(shi)藍色(se)立轉黃色(se)）。

11. 測(ce)定：以空(kong)白孔調零，450nm波長依(yi)序測(ce)量各(ge)孔的(de)吸光度（OD值(zhi)）。 測(ce)定應在(zai)加終(zhong)止液(ye)後(hou)15分(fen)鐘(zhong)以內(nei)進(jin)行(xing)。

註(zhu)意(yi)事項：

1．試(shi)劑盒從(cong)冷藏(zang)環(huan)境(jing)中取(qu)出(chu)應在(zai)室(shi)溫(wen)平衡(heng)15-30分(fen)鐘(zhong)後(hou)方可使(shi)用，酶標包(bao)被板(ban)開(kai)封後(hou)如(ru)未(wei)用完，板(ban)條應裝(zhuang)入密封袋中保(bao)存(cun)。

2．濃洗(xi)滌(di)液可能(neng)會有結(jie)晶(jing)析出(chu)，稀釋時(shi)可(ke)在(zai)水(shui)浴中加溫(wen)助(zhu)溶，洗(xi)滌(di)時(shi)不影(ying)響(xiang)結(jie)果。

3．各(ge)步加樣均(jun)應使(shi)用加樣器(qi)，並經常(chang)校(xiao)對(dui)其(qi)準(zhun)確性(xing)，以(yi)避免試(shi)驗(yan)誤(wu)差(cha)。壹次加樣時(shi)間最(zui)好(hao)控制在(zai)5分(fen)鐘(zhong)內(nei)，如(ru)標(biao)本數量多，推(tui)薦使(shi)用排槍(qiang)加樣。

4． 請每(mei)次(ci)測(ce)定的(de)同時(shi)做(zuo)標(biao)準(zhun)曲(qu)線(xian)，最(zui)好(hao)做(zuo)復(fu)孔(kong)。如(ru)標(biao)本中待測(ce)物(wu)質(zhi)含(han)量(liang)過高(gao)（樣本(ben)OD值(zhi)大(da)於(yu)標(biao)準(zhun)品(pin)孔第(di)壹孔的(de)OD值(zhi)），請先(xian)用(yong)樣(yang)品(pin)稀釋液(ye)稀釋壹定倍數(shu)（n倍）後(hou)再測(ce)定，計算(suan)時(shi)請最(zui)後(hou)乘(cheng)以(yi)總稀釋倍(bei)數(shu)（×n×5）。

5． 封板(ban)膜只限壹次性(xing)使(shi)用，以避免(mian)交(jiao)叉(cha)汙(wu)染。

6．底物(wu)請避光(guang)保(bao)存(cun)。

7．嚴(yan)格按照(zhao)說明書的(de)操作(zuo)進(jin)行(xing)，試驗結(jie)果判(pan)定必須以酶標儀讀數為準(zhun).

8．所有樣品(pin)，洗(xi)滌(di)液和各(ge)種(zhong)廢(fei)棄(qi)物(wu)都(dou)應(ying)按傳(chuan)染物(wu)處(chu)理(li)。

9．本試劑不同批(pi)號組(zu)分(fen)不得混用。

保存(cun)條件及(ji)有效期:

1．試(shi)劑盒(he)保(bao)存(cun)：；2-8℃。

2．有效期：6 個月。