實(shi)驗方(fang)法原(yuan)理：

①模(mo)板(ban)DNA的(de)變性：模(mo)板(ban)DNA經加(jia)熱至(zhi)94℃左(zuo)右(you)壹定時間(jian)後(hou)，使(shi)模(mo)板(ban)DNA雙(shuang)鏈或(huo)經(jing)PCR擴增形成的(de)雙(shuang)鏈DNA解(jie)離，使(shi)之(zhi)成為單(dan)鏈，以(yi)便(bian)它(ta)與引(yin)物(wu)結(jie)合，為(wei)下輪(lun)反(fan)應(ying)做準(zhun)備；

②模(mo)板(ban)DNA與引(yin)物(wu)的(de)退火(復(fu)性)：模(mo)板(ban)DNA經加(jia)熱變性成(cheng)單(dan)鏈後(hou)，溫(wen)度降(jiang)至(zhi)55℃左(zuo)右(you)，引物(wu)與模(mo)板(ban)DNA單(dan)鏈的(de)互補序列(lie)配(pei)對(dui)結合；

③引物(wu)的(de)延伸(shen)：DNA模(mo)板(ban)--引物(wu)結(jie)合物(wu)在Taq酶(mei)的(de)作用(yong)下，以(yi)dNTP為反(fan)應(ying)原料(liao)，靶(ba)序(xu)列(lie)為模(mo)板(ban)，按(an)堿(jian)基配(pei)對(dui)與半(ban)保留(liu)復制原理，合成(cheng)壹條(tiao)新(xin)的(de)與模(mo)板(ban)DNA 鏈互補的(de)半(ban)保留(liu)復制鏈。

重(zhong)復(fu)循環變(bian)性--退火--延(yan)伸(shen)三(san)過(guo)程，就可獲(huo)得(de)更(geng)多的(de)“半(ban)保留(liu)復制鏈"，而(er)且(qie)這(zhe)種(zhong)新(xin)鏈又可成(cheng)為(wei)下次(ci)循環的(de)模(mo)板(ban)。每(mei)完(wan)成壹個(ge)循環需2～4分鐘(zhong)， 2～3小(xiao)時就(jiu)能將待(dai)擴目的(de)基因(yin)擴增放大(da)幾百(bai)萬(wan)倍(bei)。

典型(xing)的(de)PCR包括高溫(wen)變性、低(di)溫(wen)退火、中溫(wen)延伸三(san)個(ge)步驟，通過將這(zhe)壹套過程(cheng)不(bu)斷(duan)循環，使(shi)DNA得(de)以(yi)成百(bai)萬(wan)倍(bei)的(de)擴增。

PCR擴增後(hou)出(chu)現的(de)條(tiao)帶(dai)與預(yu)計的(de)大(da)小不(bu)壹致(zhi)，或(huo)大(da)或(huo)小(xiao)，或(huo)者同(tong)時出(chu)現特(te)異性擴(kuo)增帶與非(fei)特(te)異性擴(kuo)增帶。非(fei)特(te)異性條(tiao)帶(dai)的(de)出現(xian)，其(qi)原因(yin)：

壹是(shi)引物(wu)與靶(ba)序列(lie)不全(quan)互補、或(huo)引(yin)物(wu)聚(ju)合形(xing)成(cheng)二聚(ju)體。

二是(shi)Mg2+離子濃(nong)度過高、退火溫(wen)度過低(di)，及(ji)PCR循環(huan)次(ci)數過多有(you)關。其(qi)次(ci)是(shi)酶(mei)的(de)質和(he)量，往(wang)往(wang)壹些來(lai)源(yuan)的(de)酶(mei)易出現(xian)非(fei)特(te)異條(tiao)帶(dai)而(er)另壹來(lai)源(yuan)的(de)酶(mei)則(ze)不(bu)出(chu)現，酶(mei)量過(guo)多有(you)時也(ye)會出(chu)現非(fei)特(te)異性擴(kuo)增。

其(qi)對策有(you)：

①必要時重(zhong)新(xin)設計引物(wu)。

②減低酶(mei)量或(huo)調(tiao)換另壹來(lai)源(yuan)的(de)酶(mei)。

③降(jiang)低(di)引(yin)物(wu)量，適(shi)當增加模(mo)板(ban)量，減(jian)少(shao)循環(huan)次(ci)數。

④適當提(ti)高退火溫(wen)度或(huo)采(cai)用(yong)二溫(wen)度點法(fa)(93℃變性，65℃左(zuo)右(you)退火與延(yan)伸)。

出現片狀拖帶(dai)或(huo)塗(tu)抹帶(dai)：

PCR擴增有時出(chu)現塗(tu)抹帶(dai)或(huo)片狀帶(dai)或(huo)地毯(tan)樣(yang)帶。其(qi)原因(yin)往往由(you)於酶(mei)量過(guo)多或(huo)酶(mei)的(de)質量差，dNTP濃(nong)度過高，Mg2+濃(nong)度過高，退火溫(wen)度過低(di)，循環(huan)次(ci)數過多引(yin)起。

其(qi)對策有(you)：

①減少酶(mei)量，或(huo)調(tiao)換另壹來(lai)源(yuan)的(de)酶(mei)。

②減少dNTP的(de)濃(nong)度。

③適當降(jiang)低(di)Mg2+濃(nong)度。

④增加模(mo)板(ban)量，減(jian)少(shao)循環(huan)次(ci)數。