BCA(Bicinchoninic Acid)法(fa)是(shi)壹(yi)種(zhong)常用(yong)的蛋白(bai)定(ding)量(liang)檢測(ce)方(fang)法(fa)，其原理是(shi)利用(yong)蛋白(bai)質(zhi)與銅離子在(zai)堿(jian)性溶液中(zhong)發生絡合(he)反應，生(sheng)成(cheng)穩(wen)定(ding)的紫紅色復(fu)合(he)物(wu)，再與標準(zhun)曲(qu)線比較，即可(ke)求(qiu)出(chu)待(dai)測(ce)蛋(dan)白(bai)的濃度。該方(fang)法(fa)具(ju)有靈敏(min)度高、準(zhun)確度高(gao)、操作簡(jian)便(bian)、抗幹擾(rao)能(neng)力(li)強(qiang)等優(you)點(dian)，廣(guang)泛應用(yong)於(yu)生(sheng)物(wu)化學(xue)等(deng)領(ling)域。
 

　　二、實驗步驟(zhou)
 

　　1.試劑(ji)準(zhun)備(bei)
 

　　(1)BCA工(gong)作液：將(jiang)BCA試(shi)劑(ji)A和B按(an)50:1的比例(li)混合(he)，充分(fen)搖(yao)勻，備用。
 

　　(2)標準(zhun)蛋(dan)白(bai)溶液(ye)：取適(shi)量(liang)的標準(zhun)蛋(dan)白(bai)，用PBS或去(qu)離(li)子水溶(rong)解，配制(zhi)成(cheng)濃(nong)度(du)為(wei)1mg/mL的標準(zhun)蛋(dan)白(bai)溶液(ye)。
 

　　2.蛋白(bai)樣品制備
 

　　(1)細胞裂(lie)解：將(jiang)細胞樣品離心，去除(chu)上(shang)清(qing)液(ye)，加入(ru)適量(liang)的細胞裂(lie)解液(ye)，在(zai)冰(bing)上(shang)裂(lie)解30min，使細胞充分(fen)裂(lie)解。
 

　　(2)去(qu)除(chu)雜(za)質(zhi)：將(jiang)裂(lie)解後的樣品離心，去除(chu)沈澱(dian)，保(bao)留(liu)上(shang)清(qing)液(ye)。在(zai)上(shang)清(qing)液(ye)中加(jia)入適(shi)量(liang)的SDS，使終濃度為(wei)0.1%，充分(fen)混勻(yun)。
 

　　(3)標準(zhun)曲(qu)線制(zhi)備：取適量(liang)的標準(zhun)蛋(dan)白(bai)溶液(ye)，加入(ru)適量(liang)的SDS，使終濃度為(wei)0.1%，然(ran)後分(fen)別稀(xi)釋(shi)成(cheng)不同濃度的標準(zhun)蛋(dan)白(bai)溶液(ye)。取96孔板(ban)，分(fen)別加(jia)入(ru)不同濃度的標準(zhun)蛋(dan)白(bai)溶液(ye)，每個濃度(du)設3個復(fu)孔。在(zai)每個孔中(zhong)加(jia)入(ru)BCA工(gong)作液，充分(fen)混勻(yun)。然(ran)後按(an)照(zhao)說明(ming)書要(yao)求(qiu)，在(zai)特定(ding)波(bo)長(chang)下(xia)測(ce)量(liang)吸光度(du)值(zhi)，繪(hui)制標準(zhun)曲(qu)線。
 

　　3.蛋(dan)白(bai)定(ding)量(liang)檢測(ce)
 

　　(1)取(qu)適(shi)量(liang)的待測(ce)蛋(dan)白(bai)樣品，加入適(shi)量(liang)的SDS，使終濃度為(wei)0.1%，充分(fen)混勻(yun)。然(ran)後按(an)照(zhao)標準(zhun)曲(qu)線的制備方法(fa)，加入(ru)BCA工(gong)作液，測(ce)量(liang)吸光度(du)值(zhi)。
 

　　(2)根據標準(zhun)曲(qu)線，查(zha)找出(chu)待(dai)測(ce)蛋(dan)白(bai)樣品的濃度。如果待(dai)測(ce)蛋(dan)白(bai)樣品濃度較(jiao)高(gao)，可(ke)以進行適當稀(xi)釋(shi)後再進行測(ce)定(ding)。
 

　　三、註意事項(xiang)
 

　　1.BCA工(gong)作液應儲(chu)存(cun)於(yu)4℃避光保(bao)存(cun)，避(bi)免反復(fu)凍融。
 

　　2.實(shi)驗過程中應保(bao)持樣品和標準(zhun)蛋(dan)白(bai)溶液(ye)的pH值(zhi)壹(yi)致，以保(bao)證結(jie)果的準確性。
 

　　3.在(zai)實(shi)驗過程中應避(bi)免交叉(cha)汙(wu)染(ran)，以免影響實驗結果。
 

　　4.對(dui)於壹(yi)些特殊的蛋白(bai)質(zhi)樣品，可(ke)能(neng)需(xu)要(yao)采(cai)用其(qi)他(ta)方(fang)法(fa)進行定(ding)量(liang)檢測(ce)。