壹、 貼(tie)壁細胞(bao)傳代(dai)（以(yi)壹(yi)個(ge)T25瓶(ping)為(wei)例）

1、 吸(xi)出原(yuan)培養液；

2、 加(jia)入(ru)2ml左(zuo)右(you)PBS，輕輕晃(huang)動培(pei)養瓶(ping)潤(run)洗(xi)細胞(bao)，吸(xi)出PBS丟棄(qi)；

3、 加(jia)入(ru)1ml左(zuo)右(you)yi酶(mei)，輕輕晃(huang)動培(pei)養瓶(ping)使(shi)之(zhi)浸(jin)潤(run)所(suo)有(you)細胞(bao)，放入(ru)培(pei)養箱(xiang)消化(hua)；

4、 消化(hua)時間跟(gen)據細胞(bao)特性(xing)有(you)所(suo)不(bu)同，顯(xian)微(wei)鏡下(xia)看(kan)到細胞(bao)塊中(zhong)間的細胞(bao)明顯(xian)分離(li)變圓(yuan)，側(ce)立培(pei)養瓶(ping)細胞(bao)可以滑(hua)落(luo)時可終止消(xiao)化(hua)，全程(cheng)不(bu)要拍打(da)培養瓶(ping)；

5、 加(jia)入(ru)3ml含(han)血清(qing)的培(pei)養基終止消(xiao)化(hua)，吹打(da)細胞(bao)使(shi)之(zhi)脫(tuo)落(luo)並(bing)在液體(ti)裏反復(fu)吹打(da)使(shi)細胞(bao)，使(shi)之(zhi)盡(jin)量呈單顆(ke)細胞(bao)的懸(xuan)浮(fu)液，這(zhe)時(shi)可以在顯(xian)微(wei)鏡看(kan)下(xia)；

6、 收(shou)集細胞(bao)懸(xuan)液離(li)心(xin)，1200rpm（約(yue)250g） 3分鐘，離心完吸(xi)出上(shang)清丟棄(qi)。

7、 加(jia)入(ru)新鮮(xian)培養基，吹打(da)幾下(xia)混勻細胞(bao)即可，按需(xu)接種(zhong)到新培養瓶(ping)，補足培養基，擰松瓶(ping)蓋或(huo)使(shi)用透氣瓶(ping)蓋進行培養。

8、 檢查(zha)培(pei)養箱(xiang)二(er)氧化(hua)碳(tan)，溫(wen)度(du)和水(shui)盤。

二(er)、 懸(xuan)浮(fu)細胞(bao)傳代(dai)（以(yi)壹(yi)個(ge)T25瓶(ping)為(wei)例）

1、 輕輕吹散懸(xuan)浮(fu)細胞(bao)，部分貼(tie)壁松(song)散的懸(xuan)浮(fu)細胞(bao)可直接吹打(da)培養瓶(ping)底部使(shi)細胞(bao)懸(xuan)浮(fu)，收(shou)集細胞(bao)懸(xuan)液到(dao)無(wu)菌(jun)離心(xin)管(guan)中(zhong)，離(li)心1200rpm（約(yue)250g） 3分(fen)鐘，離心完畢(bi)吸(xi)出上(shang)清丟棄(qi);

2、 加(jia)入(ru)適(shi)量新鮮(xian)培養基重懸(xuan)細胞(bao)，按比(bi)例接(jie)種(zhong)至(zhi)培養瓶(ping)（接種比(bi)例按實際情況，不(bu)確定(ding)可計數後再(zai)接種(zhong)）;

3、 常(chang)規(gui)細胞(bao)推薦以(yi)3~5×105cells/ml傳代(dai)，長(chang)到(dao)2×106cells/ml傳(chuan)出;

4、 建議剛(gang)開(kai)始幾代(dai)計(ji)數後傳(chuan)代(dai)，後(hou)面可以根(gen)據經(jing)驗按比(bi)例傳(chuan)代(dai)。

三、 半(ban)貼(tie)壁半(ban)懸(xuan)浮(fu)細胞(bao)傳代(dai)（以(yi)壹(yi)個(ge)T25瓶(ping)為(wei)例）

1、 培(pei)養液（含(han)懸(xuan)浮(fu)的細胞(bao)）：用移(yi)液器吸(xi)出培(pei)養液轉移(yi)到(dao)無(wu)菌(jun)離心(xin)管(guan)中(zhong)；

2、 貼(tie)壁部分：用1ml PBS洗(xi)細胞(bao)，吸(xi)出PBS放入(ru)到(dao)第(di)1步(bu)裝(zhuang)有(you)培養液的離(li)心(xin)管(guan)中(zhong)收(shou)集（不(bu)要直接丟棄(qi)，裏面有(you)細胞(bao)）；

3、 培養瓶(ping)加(jia)入(ru)yi 酶(mei)1ml，放入(ru)培(pei)養箱(xiang)靜(jing)置消(xiao)化(hua)；

4、 消化(hua)時間跟(gen)據細胞(bao)特性(xing)有(you)所(suo)不(bu)同，顯(xian)微(wei)鏡下(xia)看(kan)到細胞(bao)明顯(xian)收(shou)縮(suo)變圓(yuan)，側(ce)立培(pei)養瓶(ping)細胞(bao)可以滑(hua)落(luo)時可終止消(xiao)化(hua)，全程(cheng)不(bu)要拍打(da)培養瓶(ping)；

5、 用3ml含(han)血清(qing)的培(pei)養基終止消(xiao)化(hua)，將消化(hua)下(xia)來的細胞(bao)懸(xuan)液吹散細胞(bao)後收(shou)集到(dao)第(di)1步(bu)的離(li)心(xin)管(guan)；

6、 將離心(xin)管(guan)在(zai)1200rpm（約(yue)250g） 3min離心(xin)，離(li)心完畢棄(qi)掉上清，加(jia)入(ru)新的培(pei)養基重懸(xuan)，按實際情況分瓶(ping)，放入(ru)培(pei)養箱(xiang)培養。

溫(wen)馨(xin)提(ti)示：

1、 每(mei)丟棄(qi)壹(yi)個(ge)液體(ti)前都(dou)要(yao)想(xiang)壹(yi)下(xia)裏面有(you)沒(mei)有(you)可能有(you)細胞(bao)，避免(mian)丟失細胞(bao)。

2、 細胞(bao)種類(lei)、細胞(bao)密(mi)度(du)、細胞(bao)狀態(tai)、甚(shen)至(zhi)yi酶(mei)的品(pin)牌，均影響到(dao)細胞(bao)的消(xiao)化(hua)時間，所(suo)以消(xiao)化(hua)的時(shi)候(hou)不(bu)要只看(kan)時間，以顯(xian)微(wei)鏡下(xia)細胞(bao)的狀態(tai)來確定(ding)消(xiao)化(hua)終點，部分難(nan)消化(hua)的細胞(bao)消化(hua)時間甚(shen)至(zhi)可以長達(da)15分(fen)鐘。

3、 細胞(bao)的傳(chuan)代(dai)比(bi)例通(tong)常(chang)說(shuo)的是(shi)等體積的容(rong)器，不(bu)同容器需(xu)要換(huan)算；例如(ru)：壹(yi)個(ge)T25培養瓶(ping)的細胞(bao)傳到(dao)壹個(ge)10cm培養皿裏面，雖然(ran)是1傳(chuan)1，但是(shi)比(bi)例可不(bu)是1:1；T25瓶(ping)底面積25cm2，10cm培養皿底面積約為(wei)55cm²（10cm的培(pei)養皿指的是(shi)培(pei)養皿的外徑(jing)，而(er)培養皿的內(nei)徑(jing)約(yue)為(wei)8.4cm，故根(gen)據內(nei)徑可求出其(qi)底面積為(wei)55cm²），所(suo)以實(shi)際傳代(dai)比(bi)例為(wei)1:2.2。

4、 在有(you)關離(li)心(xin)機的實(shi)驗中(zhong)，標(biao)準(zhun)的離(li)心(xin)條(tiao)件應該(gai)是用RCF(relative centnifugal fieldt)來衡(heng)量，而在(zai)實(shi)際大家實驗過(guo)程(cheng)中(zhong)，往往習慣用rmp即每分鐘轉速(su)來(lai)表(biao)示；RCF即(ji)表(biao)示相(xiang)對離心(xin)場(chang)，以重(zhong)力加(jia)速(su)度(du)g(980.66cm/s2)的倍數來表(biao)示；RCF=1.119×10-5×(rpm)2×r（其(qi)中r表(biao)示離(li)心機轉軸中心與離(li)心(xin)管(guan)中(zhong)心(xin)的距離(li)，單位為(wei)cm）；所(suo)以每(mei)個(ge)實驗室(shi)離心機轉速(su)設置是(shi)不(bu)壹樣(yang)的，常(chang)規(gui)建議1200rpm 大約250g。