ELISA實驗(yan)中(zhong)應(ying)該註意的問(wen)題，包括樣品稀(xi)釋(shi)、試(shi)劑盒(he)平(ping)衡(heng)、樣品和試(shi)劑的混(hun)勻、加樣、溫育等(deng)問(wen)題(ti)。ELISA試(shi)劑盒(he)有著準(zhun)確(que)性(xing)高(gao)、靈敏(min)度(du)高(gao)、特異性(xing)強(qiang)的(de)諸多(duo)優點(dian)。然而(er),在實驗(yan)過(guo)程中(zhong),也(ye)需(xu)要註意很(hen)多(duo)問題(ti)。對(dui)此(ci)， 需(xu)要遵(zun)守壹(yi)些規(gui)則(ze),才能更(geng)好(hao)地(di)進(jin)行(xing)實驗(yan),取(qu)得(de)較好(hao)的實驗(yan)成(cheng)果(guo)。

          ELISA方(fang)法被(bei)廣(guang)泛應(ying)用於(yu)各種(zhong)抗原(yuan)和抗(kang)體(ti)測定(ding)。在ELISA測定(ding)中(zhong)影響(xiang)因(yin)素(su)較多(duo),在檢(jian)測過(guo)程中(zhong)除(chu)正(zheng)常(chang)反應(ying)外(wai),有時常(chang)見到(dao)壹(yi)些錯(cuo)誤(wu)的結(jie)果(guo)。引(yin)起ELISA測定(ding)錯誤(wu)結(jie)果(guo)的(de)原(yuan)因(yin)主要有：標(biao)本(ben)因(yin)素(su)；試(shi)劑因素(su)；操作因素(su)。ELISA實驗(yan)過(guo)程需(xu)註意事(shi)項匯(hui)總(zong)如下(xia)：

1．樣品稀(xi)釋(shi)

壹(yi)般(ban)產(chan)品(pin)的(de)樣品稀(xi)釋(shi)倍數均(jun)通過(guo)大量試(shi)驗(yan)確(que)定(ding),以(yi)保(bao)證試(shi)驗(yan)的(de)靈(ling)敏度(du)和特異性(xing).酶(mei)聯(lian)免(mian)疫(yi)反應(ying)是壹(yi)種(zhong)敏感(gan)性(xing)很(hen)高(gao)的反應(ying),如(ru)果(guo)血(xue)清(qing)不(bu)稀釋,不可(ke)避免(mian)會(hui)產(chan)生(sheng)很(hen)強(qiang)的(de)非(fei)特異性(xing)反應(ying),出(chu)現(xian)假(jia)陽性(xing)。

2．試(shi)劑盒(he)平(ping)衡(heng)

Elisa中(zhong)所(suo)有試(shi)劑和板(ban)條(tiao)均(jun)應(ying)在(zai)試(shi)驗(yan)前(qian)平(ping)衡(heng)至室(shi)溫(約25℃),壹(yi)般(ban)需(xu)在(zai)室(shi)溫放置(zhi)20～30分(fen)鐘以(yi)上.平(ping)衡(heng)時間(jian)太(tai)短(duan)會造(zao)成(cheng)試(shi)劑混勻不夠(gou),樣品孵(fu)育時(shi)間(jian)相對(dui)縮短(duan),ELISA反應(ying)不(bu)夠(gou)充(chong)分.冬季(ji)室(shi)溫低,可(ke)將試(shi)劑盒(he)置(zhi)37℃溫(wen)箱(xiang)20分(fen)鐘。

3．樣品和試(shi)劑的混(hun)勻

在稀(xi)釋前、後(hou)的(de)樣品必(bi)須(xu)充(chong)分混勻,所(suo)有試(shi)劑在加(jia)樣前也(ye)須(xu)搖(yao)勻,以(yi)保(bao)證試(shi)驗(yan)的(de)均(jun)壹(yi)性(xing)。

4．加(jia)樣

加樣是壹(yi)項很(hen)重要的(de)步(bu)驟(zhou).加樣不可(ke)太快(kuai),要避(bi)免(mian)加(jia)在(zai)孔(kong)壁上部(bu),不可(ke)濺出(chu)和產(chan)生(sheng)氣(qi)泡(pao).加樣太快(kuai),無(wu)法(fa)保(bao)證微(wei)量加樣的準(zhun)確(que)性(xing)和均(jun)壹(yi)性(xing).加(jia)在(zai)孔(kong)壁上部(bu)的非(fei)包被(bei)區,易(yi)導致非(fei)特異吸附(fu)。

5．溫育

溫(wen)育是ELISA測定(ding)中(zhong)影響(xiang)測定(ding)成敗(bai)最(zui)為(wei)關(guan)鍵的(de)壹(yi)個因(yin)素(su).ELISA作為(wei)壹(yi)種(zhong)固相免(mian)疫(yi)測定(ding),抗原(yuan)抗(kang)體(ti)的結(jie)合(he)反應(ying)在(zai)固相上進(jin)行(xing),要使(shi)液(ye)相中(zhong)的(de)抗(kang)原(yuan)或抗(kang)體與(yu)固相上的(de)特異抗體或抗原全結(jie)合(he),必(bi)須(xu)在壹(yi)定的(de)溫(wen)度(du)條(tiao)件下反應(ying)壹(yi)定的(de)時(shi)間。

6．洗板

固相免(mian)疫(yi)測定(ding)技術是壹(yi)種(zhong)非(fei)均相免(mian)疫(yi)測定(ding)技術,需(xu)以(yi)洗滌操作將特異結(jie)合(he)於(yu)固相的抗(kang)原(yuan)或抗體(ti)與(yu)反應(ying)溫(wen)育過(guo)程中(zhong)吸(xi)附(fu)的非(fei)特異成份(fen)分離(li)開(kai)來,以(yi)保(bao)證ELISA測定(ding)的特異性(xing).洗液盡(jin)量不要溢出(chu)孔(kong)外(wai)；加洗液後(hou)要靜(jing)置(zhi)1分(fen)鐘,甩去(qu)板(ban)孔(kong)中(zhong)洗液後(hou),壹(yi)定要大(da)力(li)拍(pai)幹(gan)；及(ji)時(shi)更(geng)換(huan)吸(xi)水(shui)紙,尤其是拍(pai)過(guo)酶(mei)標(biao)記(ji)物(wu)的(de)吸(xi)水(shui)紙壹(yi)定要棄(qi)去(qu),否(fou)則可(ke)能影響(xiang)試(shi)驗(yan)結(jie)果(guo)。

7．顯(xian)色(se)

顯(xian)色(se)壹(yi)定要控制時(shi)間(jian),根據(ju)試(shi)劑盒(he)說(shuo)明(ming)操作即可(ke).壹(yi)般(ban)來說(shuo),顯(xian)色(se)時間(jian)過(guo)短(duan),結(jie)果(guo)偏(pian)低(di)；顯(xian)色(se)時間(jian)過(guo)長,空白增(zeng)高(gao)或者(zhe)非(fei)特異性(xing)顯(xian)色(se)增加(jia)。

8．比(bi)色(se)

比(bi)色(se)要註意波長(chang)的選擇(ze).以(yi)TMB為(wei)底物和以(yi)OPD為(wei)底物的試(shi)劑盒(he)均(jun)有使用,而(er)前者比(bi)色(se)波長(chang)為(wei)450nm,後(hou)者(zhe)為(wei)492nm,濾(lv)光片需(xu)根(gen)據(ju)要求(qiu)隨(sui)時(shi)更(geng)換(huan).因(yin)此(ci),容易(yi)出(chu)現濾(lv)光(guang)片錯用的問(wen)題。