PCR原(yuan)理(li)是DNA分(fen)子(zi)兩條單(dan)鏈(lian)以雙螺(luo)旋(xuan)結構(gou)結成(cheng)，DNA兩條鏈(lian)擁有(you)自行(xing)粘附(fu)的(de)特(te)性(xing)，A與T配(pei)對，C與G配(pei)對，DNA粘(zhan)附(fu)特(te)性(xing)是PCR的(de)核心原(yuan)理(li)。同(tong)時DNA復制時(shi)也(ye)是具(ju)有(you)方向(xiang)性(xing)的(de)，DNA序列的(de)開(kai)始(shi)端(duan)稱為(wei)5‘端(duan)，末端稱(cheng)為(wei)3’端(duan)。
 

　　在(zai)復制時(shi)，需(xu)要(yao)加入(ru)壹(yi)種叫(jiao)做(zuo)引(yin)物(wu)(primers)的(de)東西(xi)。可以將引物(wu)理(li)解(jie)為(wei)壹(yi)個短(duan)序(xu)列，下圖(tu)中(zhong)紅色的(de)部分(fen)就是引(yin)物(wu)。引(yin)物(wu)通(tong)常(chang)15到20個堿(jian)基(ji)，可(ke)以短(duan)壹些(xie)，也(ye)可(ke)以長(chang)壹些(xie)。但(dan)是必(bi)須(xu)和我們(men)想合(he)成(cheng)的(de)DNA片(pian)段成(cheng)互(hu)補(bu)關(guan)系。將引物(wu)與DNA鏈(lian)混(hun)合(he)時(shi)，會自(zi)動粘在(zai)上(shang)面，因為(wei)他(ta)們(men)是互(hu)補(bu)的(de)。引物(wu)獲得(de)可(ke)以從(cong)公(gong)司(si)訂購，後續有(you)機會我們(men)也(ye)會(hui)分享引物(wu)設(she)計方法。下面了解PCR反(fan)應DNA體(ti)外(wai)復制的(de)所需條件(jian)如下：
 

　　壹、模板(ban)和底(di)物(wu)
 

　　DNA復制是模(mo)板(ban)依(yi)賴(lai)性的(de)，必須以親(qin)代DNA鏈作(zuo)為(wei)模(mo)板(ban)，親(qin)代DNA的(de)兩股鏈解(jie)開(kai)後，可分別(bie)作(zuo)為(wei)模(mo)板(ban)進(jin)行(xing)復制。同(tong)時(shi)，DNA復制需(xu)要(yao)以四(si)種脫(tuo)氧核糖(tang)核苷(gan)酸(suan)，即dATP、dGTP、dCTP、dTTP，為(wei)底(di)物(wu)合(he)成(cheng)子代DNA。
 

　　在體(ti)外(wai)進行(xing)DNA復制時(shi)，模(mo)板和底(di)物(wu)均(jun)可通(tong)過(guo)人(ren)工(gong)添加解決。
 

　　二(er)、引物(wu)
 

　　DNA聚合(he)酶必須(xu)以壹(yi)段具有(you)3’端自(zi)由羥基(ji)(3’-OH)的(de)RNA作為(wei)引(yin)物(wu)，才(cai)能(neng)開(kai)始(shi)合(he)成(cheng)子代DNA鏈。
 

　　在(zai)體(ti)外(wai)進行(xing)DNA復制時(shi)，可(ke)以人(ren)工(gong)合(he)成(cheng)具有(you)特(te)定(ding)序(xu)列的(de)寡(gua)核苷(gan)酸(suan)作為(wei)引(yin)物(wu)，該(gai)引物(wu)序(xu)列與進(jin)行(xing)擴增(zeng)的(de)目的(de)核酸(suan)片(pian)段互(hu)補(bu)匹(pi)配，從(cong)而(er)開(kai)始(shi)目的(de)片(pian)段的(de)擴增(zeng)。
 

　　因為(wei)引(yin)物(wu)的(de)堿(jian)基(ji)序(xu)列需(xu)要(yao)與目的(de)片(pian)段相匹(pi)配，在(zai)合(he)成(cheng)引物(wu)之前，必(bi)須首(shou)先(xian)已(yi)知(zhi)目的(de)片(pian)段的(de)堿(jian)基(ji)序(xu)列，至(zhi)少(shao)也(ye)要(yao)知(zhi)道(dao)目的(de)片(pian)段的(de)部分(fen)序列，從(cong)而(er)確(que)定(ding)合(he)成(cheng)引物(wu)的(de)堿(jian)基(ji)序(xu)列。
 

　　三(san)、模(mo)板雙鏈的(de)解旋
 

　　在DNA的(de)半保留(liu)復制機制中(zhong)，雙鏈DNA的(de)解旋是在(zai)拓(tuo)撲(pu)異(yi)構酶和解(jie)鏈酶的(de)作用下完(wan)成(cheng)的(de)，該(gai)過程需(xu)要(yao)拓撲(pu)異(yi)構酶識(shi)別DNA的(de)復制起點(dian)才(cai)能(neng)開(kai)啟(qi)，而體(ti)外(wai)擴增(zeng)特(te)定(ding)的(de)核酸(suan)片(pian)段只(zhi)需要(yao)特(te)異(yi)性(xing)的(de)復制目的(de)核酸(suan)片(pian)段，因而需(xu)要(yao)壹種(zhong)方式(shi)使(shi)得(de)模板(ban)DNA解(jie)旋為(wei)單(dan)鏈(lian)DNA，之後在使(shi)之與引(yin)物(wu)結合(he)，從(cong)而(er)特(te)異(yi)性(xing)的(de)擴增(zeng)目的(de)核酸(suan)片(pian)段。
 

　　三、DNA的(de)變性
 

　　DNA變性(xing)是指(zhi)核酸(suan)雙螺(luo)旋(xuan)結構(gou)中(zhong)堿(jian)基(ji)對的(de)氫鍵斷裂，使(shi)得(de)雙鏈變(bian)為(wei)單(dan)鏈(lian)的(de)過程。
 

　　對雙鏈DNA進(jin)行加熱(re)可(ke)以使(shi)其(qi)發生(sheng)變性(xing)，當溫度(du)升高到壹(yi)定(ding)高(gao)度(du)時，DNA在260nm處的(de)吸(xi)光(guang)度(du)會突然發(fa)生(sheng)明顯的(de)上升，並(bing)達到最(zui)大(da)值(zhi)，之後溫度(du)繼(ji)續(xu)上升，其(qi)吸(xi)光(guang)度(du)也(ye)不會(hui)發(fa)生(sheng)明顯變化，若(ruo)以溫度(du)對DNA溶(rong)液(ye)的(de)260nm吸(xi)光(guang)度(du)做(zuo)圖(tu)，會(hui)得到典型的(de)DNA變性S型曲(qu)線(xian)。
 

　　DNA的(de)變性是在(zai)壹(yi)個很(hen)窄(zhai)的(de)溫度(du)範圍內發生(sheng)的(de)，通(tong)常(chang)將核酸(suan)加熱(re)變(bian)性(xing)過(guo)程中(zhong)，紫(zi)外(wai)光(guang)吸(xi)收(shou)值(zhi)達到最(zui)大(da)值(zhi)50%時的(de)溫度(du)稱為(wei)核酸(suan)的(de)熔(rong)解溫度(du) (Tm, melting temperature)。
 

　　1. 特(te)定(ding)核酸(suan)分(fen)子的(de)Tm值(zhi)與其(qi)G+C含量(liang)成(cheng)正相(xiang)關(guan)，GC% = (Tm-69.3) × 2.44；
 

　　2. Tm值(zhi)的(de)大(da)小(xiao)還(hai)與核酸(suan)分(fen)子的(de)長度(du)有(you)關(guan)，核酸(suan)分(fen)子越(yue)長(chang)，Tm值(zhi)越大(da)；
 

　　3. 粒(li)子(zi)強(qiang)度(du)越高，熔(rong)解溫度(du)越高，熔(rong)解溫度(du)範圍越窄。
 

　　四(si)、DNA的(de)復性
 

　　加熱(re)變(bian)性(xing)的(de)DNA在緩慢(man)冷卻(que)後可以由(you)單鏈(lian)恢復為(wei)雙鏈結構(gou)，這壹過程稱(cheng)為(wei)DNA的(de)復性，也(ye)稱(cheng)為(wei)“退火 (annealing)"。
 

　　當溫度(du)降低至比(bi)變性(xing)DNA的(de)Tm低25℃時，其(qi)復性效果*佳，越(yue)遠(yuan)離此溫度(du)，復性效果越差(cha)。
 

　　因此，可(ke)以利(li)用此(ci)特(te)性(xing)，在(zai)加熱(re)使(shi)模(mo)板DNA變(bian)性(xing)後，將溫度(du)降低至特(te)定(ding)溫度(du)，從(cong)而(er)使(shi)所(suo)加引物(wu)與模(mo)板(ban)DNA復性結合(he)，進(jin)而能(neng)夠對引(yin)物(wu)所(suo)規定(ding)的(de)核酸(suan)片(pian)段進行(xing)特(te)異(yi)性(xing)的(de)擴增(zeng)。
 

　　五(wu)、DNA聚合(he)酶
 

　　為(wei)了使(shi)模(mo)板中(zhong)特(te)定(ding)的(de)核酸(suan)片(pian)段進行(xing)擴增(zeng)，在(zai)模(mo)板(ban)與引(yin)物(wu)結合(he)後，需要(yao)有(you)DNA聚合(he)酶的(de)參(can)與，但(dan)是由(you)於DNA變性(xing)和復性過程的(de)溫度(du)較高，普通(tong)的(de)DNA聚合(he)酶在此(ci)過(guo)程中(zhong)會(hui)由(you)於溫度(du)過高而(er)失(shi)活。
 

　　科(ke)學(xue)家為(wei)了解決(jue)該(gai)問(wen)題，從(cong)水(shui)生(sheng)棲熱(re)菌 (Thermus Aquaticus) 中(zhong)分(fen)離(li)出了具有(you)熱(re)穩定(ding)性的(de)DNA聚合(he)酶，該(gai)酶可以耐受(shou)90℃以上(shang)的(de)高溫而不失(shi)活。