操作要點：
1、將培養(yang)基(ji)在37℃水(shui)浴(yu)鍋預熱(re)；準備(bei)壹個15mL無(wu)菌的(de)離(li)心(xin)管(guan)，加(jia)入(ru)8mL預熱(re)培養(yang)基(ji)。
2、將凍存細(xi)胞從(cong)液(ye)氮(dan)罐中(zhong)取出，快速(su)放(fang)入(ru)37℃水(shui)浴(yu)鍋中(zhong)復溫(wen)（可(ke)準備(bei)壹潔凈的(de)燒(shao)杯(bei)，裝(zhuang)滿37℃的水(shui)，細(xi)胞凍存管(guan)取出後(hou)迅速放入(ru)燒杯(bei)內(nei)，再逐步轉(zhuan)移到(dao)水(shui)浴(yu)鍋中(zhong)）。輕輕晃動凍存管(guan)，使(shi)細(xi)胞能(neng)在1~2min內(nei)*解(jie)凍，使(shi)細(xi)胞能(neng)盡(jin)快通(tong)過易受(shou)損的溫度段（-5~0℃）。註意(yi)凍存管(guan)管(guan)口不(bu)能(neng)沒入(ru)水(shui)中(zhong)，BRL(大(da)鼠(shu)肝細(xi)胞)避(bi)免(mian)引起(qi)汙染。

3、用(yong)75%酒精(jing)擦(ca)拭(shi)凍存管(guan)後(hou)再置於超(chao)凈臺內(nei)，將(jiang)管(guan)內(nei)細(xi)胞轉(zhuan)移至(zhi)準備(bei)好(hao)的(de)離(li)心(xin)管(guan)內(nei)，輕輕吹打(da)液體(ti)，使(shi)細(xi)胞均(jun)勻分(fen)散(san)，降(jiang)低DMSO濃度，吹打(da)時避(bi)免(mian)產生氣泡(pao)。用(yong)新鮮培養(yang)基(ji)洗管(guan)壁2次(ci)，均(jun)轉(zhuan)移至(zhi)離(li)心(xin)管(guan)內(nei)。
4、800rpm離(li)心(xin)5min，棄上清，加(jia)入(ru)新鮮的(de)培養(yang)基(ji)，吹打(da)制成(cheng)細(xi)胞懸(xuan)液。
5、將(jiang)細(xi)胞懸(xuan)液轉(zhuan)移至(zhi)T25細(xi)胞瓶(ping)內(nei)，補(bu)加(jia)適(shi)量(liang)的培養(yang)基(ji)，輕輕晃動細(xi)胞瓶(ping)使(shi)細(xi)胞分(fen)布(bu)均(jun)勻，放(fang)入(ru)溫箱(xiang)內(nei)培養(yang)。
6、第(di)二(er)天(tian)觀察細(xi)胞貼(tie)壁生(sheng)長(chang)情(qing)況(kuang)，換新(xin)鮮培養(yang)基(ji)以去(qu)除死(si)細(xi)胞。繼(ji)續培養(yang)，待(dai)細(xi)胞長(chang)至(zhi)80~90%匯合時正(zheng)常傳代。壹(yi)般剛(gang)復(fu)蘇的(de)細(xi)胞需經(jing)過2~3次(ci)傳(chuan)代，細(xi)胞活力恢(hui)復後(hou)才(cai)能(neng)進(jin)行(xing)後續的實(shi)驗(yan)。

註意(yi)事(shi)項(xiang)：
1. 接(jie)收到(dao)細(xi)胞，肉(rou)眼觀(guan)察細(xi)胞培養(yang)基(ji)顏色，顯微(wei)鏡(jing)觀察細(xi)胞生(sheng)長情(qing)況(kuang)，並對(dui)細(xi)胞進(jin)行(xing)不(bu)同倍(bei)數拍照(zhao)（建議(yi)收到(dao)時的(de)培養(yang)瓶(ping)拍(pai)壹(yi)張(zhang)照(zhao)片(pian)，顯微(wei)鏡(jing)拍收到(dao)時的(de)細(xi)胞100X,200X各(ge)壹張(zhang)）。
2.用(yong)75%的酒(jiu)精(jing)消毒（建議(yi)配置(zhi)75%的(de)酒(jiu)精的水(shui)是(shi)滅(mie)菌過的）。
3.嚴(yan)格(ge)無(wu)菌操(cao)作，打(da)開(kai)細(xi)胞培養(yang)瓶(ping)。
4.將(jiang)細(xi)胞培養(yang)瓶(ping)內(nei)的(de)培養(yang)基(ji)用(yong)吸(xi)管(guan)*吸(xi)出（嚴(yan)禁直(zhi)接(jie)傾倒），放(fang)入(ru)另壹(yi)無(wu)菌容(rong)器中(zhong)（建議(yi)換新(xin)的培養(yang)基(ji)培養(yang)細(xi)胞）。
5.用(yong)PBS 2-3ml/次(ci)輕輕洗細(xi)胞表(biao)面(mian)，洗(xi)3-4次(ci)遍(bian)，加(jia)入(ru)0.05%-EDTA1-1.5ml,顯微(wei)鏡(jing)下觀察細(xi)胞變(bian)圓(yuan)，輕輕拍打(da)培養(yang)瓶(ping)直(zhi)到(dao)細(xi)胞脫(tuo)落，加(jia)入(ru)終止(zhi)液(ye)終止(zhi)。
6.1000rpm，5min離(li)心(xin)，重(zhong)懸(xuan)細(xi)胞。
7.換新(xin)的細(xi)胞培養(yang)瓶(ping)，37℃，5%CO2培養(yang)。