不(bu)同(tong)的實(shi)驗(yan)方(fang)法(fa)需(xu)要不同的抗(kang)體(ti)特性(xing)，因為抗(kang)原(yuan)以(yi)不(bu)同的方(fang)式(shi)呈現。在變(bian)性(xing)SDS-PAGE 後，抗(kang)原(yuan)可(ke)能(neng)是蛋(dan)白質(zhi)印(yin)跡檢測(ce)中(zhong)呈(cheng)線性(xing)的氨(an)基酸(suan)序(xu)列，或(huo)者在細(xi)胞(bao)免(mian)疫(yi)分離、免(mian)疫(yi)沈(chen)澱或(huo)基於 ELISA 的方(fang)法(fa)中(zhong)整(zheng)體(ti)是天然結(jie)構(gou)。在免(mian)疫(yi)染(ran)色(se)中(zhong)，必(bi)須(xu)檢測(ce)固(gu)定細(xi)胞(bao)或(huo)組(zu)織中(zhong)的交(jiao)聯、化學修(xiu)飾(shi)結(jie)構(gou)。這(zhe)意(yi)味(wei)著(zhe)壹種抗體(ti)可(ke)能(neng)在壹種應用(yong)中(zhong)表(biao)現出優異的性(xing)能(neng)，但在另壹種應用(yong)中(zhong)卻(que)不(bu)適(shi)用。這(zhe)也(ye)意(yi)味(wei)著(zhe)壹種檢測(ce)的特(te)異性(xing)並(bing)不能(neng)保(bao)證(zheng)在不(bu)同應用(yong)中(zhong)的特(te)異性(xing)。必(bi)須(xu)對所(suo)有應用(yong)程(cheng)序(xu)獨立(li)進(jin)行(xing)驗(yan)證(zheng)。下(xia)面詳述下抗(kang)體(ti)驗證(zheng)的八(ba)種方(fang)法(fa)：

1. 省(sheng)略壹抗

這(zhe)是測(ce)試(shi)由二(er)級試(shi)劑引起(qi)的潛(qian)在背(bei)景的有用且(qie)重(zhong)要的控制(zhi)。然而(er)，這(zhe)個實(shi)驗(yan)沒(mei)有提(ti)供(gong)關於壹抗質(zhi)量的信(xin)息(xi)。

2.抗(kang)體(ti)信(xin)號與(yu)文獻(xian)數(shu)據(ju)壹致(zhi)

WB 中(zhong)觀(guan)察(cha)到(dao)的分子(zi)量、組(zu)織分布(bu)和(he)染色模式(shi)與(yu)文獻(xian)壹致(zhi)。這種驗證(zheng)方(fang)法(fa)很容易(yi)執(zhi)行(xing)，但(dan)也(ye)有壹些(xie)限(xian)制(zhi)；例如(ru)，WB 中(zhong)條(tiao)帶(dai)的正確分子(zi)量並(bing)不壹定會(hui)告(gao)訴您該條(tiao)帶(dai)是(shi)所需(xu)的目(mu)標(biao)蛋白質(zhi)。在 WB 中(zhong)很容易(yi)有數(shu)百(bai)種蛋白質(zhi)以(yi)相(xiang)同的速(su)度運行(xing)，這(zhe)可(ke)能(neng)會導(dao)致(zhi)對結(jie)果(guo)的誤(wu)解。文獻(xian)中(zhong)的數(shu)據(ju)也(ye)可(ke)能(neng)不正確或不完整。

3. 轉(zhuan)染細胞(bao)以(yi)過(guo)表(biao)達(da)靶(ba)抗(kang)原(yuan)

在表(biao)現出弱內源性(xing)表(biao)達(da)或(huo)無(wu)內源性(xing)表(biao)達(da)的細(xi)胞(bao)系(xi)中(zhong)，過(guo)表(biao)達(da)靶(ba)蛋(dan)白可(ke)以(yi)給(gei)出抗體(ti)特異性(xing)和敏感性(xing)的問題。通過(guo)這(zhe)種方(fang)法(fa)可(ke)以(yi)很容易(yi)地(di)評(ping)估與(yu)同壹蛋白質(zhi)的不(bu)同亞(ya)型(xing)的反(fan)應性(xing)。然而(er)，人(ren)為的高(gao)水平(ping)靶(ba)蛋白通常(chang)不(bu)能(neng)反映(ying)內源性(xing)表(biao)達(da)水平(ping)。組(zu)織或細(xi)胞(bao)裂(lie)解物(wu)中(zhong)預期(qi)大(da)小(xiao)或(huo)定位(wei)的幹(gan)凈(jing)信(xin)號，已(yi)知含(han)有目的蛋(dan)白質(zhi)，結(jie)合(he)過(guo)表(biao)達(da)系(xi)統中(zhong)的陽(yang)性(xing)結(jie)果(guo)，是(shi)特(te)異(yi)性(xing)的良(liang)好指標(biao)。

4.用免(mian)疫(yi)原(yuan)阻斷(duan)/預吸(xi)附(fu)抗體(ti)

特別是對於多克隆血清(qing)，這是確定觀(guan)察(cha)到(dao)的信(xin)號是否與(yu)免(mian)疫(yi)抗(kang)原(yuan)相關的有用實(shi)驗(yan)。如(ru)果信(xin)號在預吸(xi)附(fu)後消(xiao)失，則(ze)該信(xin)號很有可(ke)能(neng)是特(te)異性(xing)的。然(ran)而(er)，不(bu)能(neng)排(pai)除(chu)與(yu)共享(xiang)類(lei)似(si)抗(kang)體(ti)結(jie)合(he)表(biao)位(wei)的其(qi)他(ta)蛋(dan)白質(zhi)發(fa)生交(jiao)叉(cha)反應的可(ke)能(neng)性(xing)（可(ke)在此(ci)處(chu)找(zhao)到(dao)建(jian)議的預吸(xi)附(fu)方(fang)案(an)）。

5.KO細(xi)胞(bao)或(huo)組(zu)織

KO(Knock-out)敲(qiao)除(chu)測試(shi)抗體(ti)特異性(xing)的金(jin)標(biao)準(zhun)。與(yu)野生(sheng)型相比(bi)，KO中(zhong)的信(xin)號丟(diu)失是(shi)特(te)異性(xing)的zui可(ke)靠證(zheng)據(ju)。請(qing)記(ji)住，在蛋(dan)白質(zhi)印(yin)跡中(zhong)成(cheng)功(gong)的KO驗(yan)證(zheng)並(bing)不能(neng)保(bao)證(zheng)在其(qi)他(ta)應(ying)用(yong)（如(ru)免(mian)疫(yi)染(ran)色(se)）中(zhong)的特(te)異性(xing)。不幸的是(shi)，KO細胞(bao)或(huo)組(zu)織並(bing)不總(zong)是(shi)可(ke)用的。

6.KD-細(xi)胞(bao)或(huo)組(zu)織

KD(Knock-down)目標(biao)的敲(qiao)低也(ye)可(ke)以(yi)告(gao)訴您很多關於抗(kang)體(ti)特異性(xing)的信(xin)息(xi)。與(yu)KO相比(bi)，通過(guo) RNAi下(xia)調(tiao)蛋(dan)白質(zhi)通常(chang)更(geng)快、更(geng)容(rong)易完成。根(gen)據(ju)降(jiang)低(di)的mRNA水平(ping)，與(yu)對照(zhao)系(xi)統相(xiang)比(bi)，KD模型中(zhong)的信(xin)號或染(ran)色(se)應(ying)減少(shao)。有時KD不(bu)是(shi)很有效，結(jie)果(guo)的解(jie)釋可(ke)能(neng)很困難。

7.IP或ELISA應用的IP/MS驗(yan)證(zheng)

免(mian)疫(yi)沈(chen)澱 (IP)以(yi)及(ji)隨(sui)後通過(guo)質(zhi)譜(pu)(MS)進(jin)行(xing)的蛋(dan)白質(zhi)鑒(jian)定是(shi)分析(xi)IP或(huo)ELISA應(ying)用(yong)的抗(kang)體(ti)特異性(xing)的強大(da)工具(ju)。然而(er)，這(zhe)種方(fang)法(fa)並(bing)沒(mei)有告(gao)訴您很多關於其(qi)他(ta)應(ying)用(yong)（如(ru)蛋白質(zhi)印(yin)跡或免(mian)疫(yi)染(ran)色(se)）中(zhong)抗(kang)體(ti)特異性(xing)的信(xin)息(xi)。

8.針(zhen)對同(tong)壹目標(biao)不同(tong)表(biao)位(wei)的抗(kang)體(ti)

這種驗證(zheng)方(fang)法(fa)可(ke)以(yi)提(ti)供(gong)有關抗體(ti)特異性(xing)的寶(bao)貴(gui)數(shu)據(ju)，尤(you)其(qi)是在免(mian)疫(yi)染(ran)色(se)或(huo)蛋白質(zhi)印(yin)跡應用中(zhong)。用(yong)針(zhen)對同(tong)壹目標(biao)但具(ju)有不同(tong)表(biao)位(wei)的抗(kang)體(ti)獲得的匹(pi)配染(ran)色(se)模式(shi)為其(qi)特異(yi)性(xing)提(ti)供(gong)了很好的證(zheng)據(ju)。結(jie)合(he)靶(ba)蛋(dan)白不同(tong)部(bu)分的不(bu)同抗體(ti)不太可(ke)能(neng)具(ju)有相同(tong)的非(fei)特異性(xing)結(jie)合(he)配偶(ou)體(ti)。

總(zong)結(jie)：

如(ru)果妳(ni)有 KO 模型(xing)，則(ze)抗體(ti)的驗(yan)證(zheng)非(fei)常簡單明了。如(ru)果這(zhe)個黃金(jin)標(biao)準(zhun)不可(ke)用，則(ze)必(bi)須(xu)收(shou)集(ji)盡(jin)可(ke)能(neng)多的關於目(mu)標(biao)和抗(kang)體(ti)本(ben)身的信(xin)息(xi)和(he)驗(yan)證(zheng)數(shu)據(ju)，以(yi)產(chan)生高概率(lv)的特(te)異性(xing)。