聚合(he)酶(mei)鏈(lian)反(fan)應(ying)(PCR)技術(shu)是在體外進行(xing)的(de)由(you)引物介導(dao)的(de)酶(mei)促(cu)DNA擴增反(fan)應(ying)。PCR 反(fan)應(ying)特(te)異(yi)性優(you)化(hua)方(fang)法(fa)合(he)集：

1. 引物的(de)設計(ji)

引物最好(hao)在模板 cDNA 的(de)保(bao)守區設計(ji)，長(chang)度(du) 15-30bp，GC 含(han)量小於(yu) 60%，3’端(duan)不超(chao)過連(lian)續(xu)三(san)個(ge) G 或 C，堿(jian)基分布(bu)錯(cuo)落有致(zhi)，避免引物自身形成(cheng)二(er)聚(ju)體(ti)，設計(ji)完(wan)成(cheng)之(zhi)後(hou)，需(xu)進行(xing) BLAST 檢測，如果與(yu)其他(ta)基因不具(ju)有互(hu)補(bu)性(xing)，則可(ke)以(yi)進行(xing)下壹(yi)步實(shi)驗(yan)。

2. 降落 PCR

降落 PCR 是壹(yi)種簡單(dan)的(de)降低(di)非(fei)特(te)異(yi)性產物的(de) PCR，最大(da)的(de)優(you)點就是可(ke)以(yi)降低(di)實(shi)驗(yan)耗時(shi)，同(tong)時(shi)又可以(yi)優(you)化(hua)實(shi)驗(yan)的(de)步驟。引物的(de)設計(ji)決(jue)定(ding)退(tui)火(huo)溫度，退(tui)火(huo)溫度過高會(hui)使(shi) PCR 效率(lv)過低(di)，過低(di)則會(hui)使(shi)非特(te)異(yi)擴增過多(duo)。這(zhe)雖(sui)然可以(yi)通過反(fan)復嘗試(shi)來優(you)化(hua)，但(dan)費時(shi)費力(li)。降落 PCR 提供了(le)壹(yi)個較為(wei)簡易(yi)的(de)優(you)化(hua)方(fang)法(fa)。首先在較高的(de)溫度下(xia)擴增，此(ci)時(shi)雖然擴增效率(lv)低(di)，但(dan)非(fei)特(te)異(yi)擴增基本沒有(you)。隨(sui)著退(tui)火(huo)溫度的(de)降低(di)，非(fei)特(te)異(yi)擴增會逐(zhu)步增多(duo)。但(dan)由(you)於(yu)此(ci)時(shi)特(te)異(yi)的(de)擴(kuo)增產物已經(jing)達到壹(yi)定的(de)數量優(you)勢，因(yin)此(ci)會對(dui)非(fei)特(te)異(yi)擴增產生(sheng)強烈(lie)的(de)競(jing)爭抑(yi)制(zhi)，從(cong)而大幅提(ti)高 PCR 的(de)特(te)異(yi)性和(he)效率(lv)。

3. 熱(re)啟(qi)動擴增

采用熱啟(qi)動方(fang)法(fa)進(jin)行(xing)擴增，是除(chu)了(le)設計(ji)最佳(jia)引物之外(wai)，提(ti)高 PCR 反(fan)應(ying)特(te)異(yi)性方(fang)式。在壹(yi)般的(de) PCR 反(fan)應(ying)中，試(shi)劑(ji)的(de)配(pei)置(zhi)需(xu)在冰(bing)上進(jin)行(xing)，且要將(jiang) PCR 儀預熱，這(zhe)種方(fang)法(fa)就類似於(yu)熱啟(qi)動，能夠壹(yi)定程度(du)的(de)抑(yi)制(zhi)錯(cuo)配(pei)。但(dan)是酶(mei)在低溫下也(ye)存在活性，只(zhi)要體(ti)系(xi)中有(you) DNA 鏈(lian)存在，就會(hui)擴(kuo)增產生(sheng)非(fei)特(te)異(yi)性條(tiao)帶。采用熱啟(qi)動的(de)方(fang)法(fa)就是在達到變性(xing)溫度之(zhi)前(qian)抑(yi)制(zhi)酶(mei)的(de)活性，方(fang)法(fa)就是使(shi)用熱啟(qi)動 Taq 酶(mei)（或熱(re)啟(qi)動高保(bao)真聚合(he)酶(mei)）去擴(kuo)增，它(ta)的(de)原(yuan)理就是采(cai)用化(hua)學(xue)修(xiu)飾的(de)方(fang)法(fa)封閉酶(mei)的(de)活性中心(xin)，當(dang)溫度上(shang)升到 95℃時(shi)恢復活性，指導擴(kuo)增。

4. 巢(chao)式 PCR

采(cai)用巢(chao)式 PCR 進(jin)行(xing)擴增，在多(duo)輪(lun)擴(kuo)增結果(guo)中提(ti)高擴(kuo)增特(te)異(yi)性和(he)靈(ling)敏度(du)。與(yu)普通(tong) PCR 不同(tong)的(de)是，它(ta)采用兩對(dui)引物進行(xing)擴增，首先用第壹(yi)對(dui)引物普通(tong) PCR，然(ran)後(hou)將(jiang)第壹(yi)輪(lun)擴(kuo)增的(de)產物稀釋(shi) 100 倍後(hou)用第二對(dui)引物（巢(chao)式引物）二次(ci)擴(kuo)增。因此(ci)采用巢(chao)式 PCR 可(ke)以(yi)大大(da)增加困(kun)難(nan)模(mo)板擴增的(de)特(te)異(yi)性和(he)有限靶序(xu)列(lie)的(de)靈(ling)敏度(du)。合(he)適的(de)瓊(qiong)脂(zhi)糖(tang)凝(ning)膠(jiao)的(de)濃度(du)。