酶(mei)聯免(mian)疫吸附(fu)試(shi)驗(yan)（enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）指(zhi)將(jiang)可溶(rong)性的(de)抗(kang)原或(huo)抗(kang)體結合到聚(ju)苯(ben)乙烯等(deng)固(gu)相載體(ti)上(shang)，利(li)用抗(kang)原抗(kang)體結合專(zhuan)壹性(xing)進(jin)行(xing)免(mian)疫反(fan)應(ying)的(de)定性(xing)和(he)定(ding)量檢(jian)測方(fang)法。它是(shi)應(ying)用(yong)最(zui)多(duo)的(de)壹種(zhong)免(mian)疫酶(mei)技(ji)術(shu)。

   ELISA 測定的(de)陽性(xing)判斷值, 通常是(shi)將(jiang)大量陰(yin)性(xing)和(he)陽(yang)性人(ren)群的(de)測定數(shu)據(ju)進(jin)行(xing)統(tong)計分(fen)析(xi)後(hou)確(que)定(ding)的(de), 其確(que)定依據(ju)為(wei)判(pan)斷(duan)結果的(de)假陽(yang)性和(he)假(jia)陰(yin)性(xing)率(lv)最(zui)di。在(zai)陽(yang)性(xing)判(pan)斷值周(zhou)圍(wei)壹定(ding)範圍(wei)內(nei)之外(wai)的(de)測定結果可歸(gui)為(wei)可疑(yi), 亦即ELISA 測定的(de)“灰(hui)區(qu)"。“灰(hui)區(qu)"的(de)大小可用(yong)統(tong)計學(xue)方(fang)法確定。測定結果處(chu)於(yu)“灰(hui)區(qu)"的(de)樣本(ben), 可通(tong)過(guo)確(que)認(ren)試(shi)驗(yan)或(huo)追蹤(zong)檢(jian)測來確(que)定(ding)到底(di)是(shi)陽(yang)性還(hai)是(shi)陰(yin)性(xing)ELISA“灰(hui)區(qu)"是(shi)把定(ding)量(liang)分(fen)析(xi)的(de)正常值範圍(wei)引入(ru)定(ding)性分(fen)析(xi)而(er)建(jian)立(li)的(de)概念(nian)。灰(hui)區(qu)的(de)設(she)置有(you)二(er)種(zhong): (1)CO × (1±C) , C 為(wei)該(gai)試(shi)劑(ji)的(de)批內(nei)C (壹般(ban)在(zai)15%～ 20% 間) ; (2)CO ±2S, S 為(wei)做(zuo)室(shi)內ROC 的(de)S，現(xian)分(fen)析(xi)如(ru)下(xia)。

1 、方(fang)法學(xue)的(de)影(ying)響

 ELISA 測定模式包括以下(xia)幾種(zhong): 雙(shuang)抗(kang)體夾(jia)心(xin)法、間接(jie)法、雙(shuang)抗(kang)原夾(jia)心(xin)法、IgM 抗(kang)體捕(bu)捉(zhuo)法、競爭抑制(zhi)法, 其中競爭(zheng)抑(yi)制(zhi)法因受操(cao)作(zuo)時(shi)差所(suo)引起(qi)的(de)bu 公平(ping)競爭等(deng)因素的(de)影(ying)響, 結果重復(fu)性較差, 質(zhi)量(liang)較難控(kong)制(zhi)。

2 、試(shi)劑(ji)因(yin)素

試(shi)劑(ji)的(de)選擇(ze)　檢(jian)測的(de)原理(li)均基(ji)於(yu)抗(kang)原抗(kang)體反(fan)應(ying)。由(you)於(yu)該(gai)反(fan)應(ying)過(guo)程(cheng)受多(duo)種(zhong)因(yin)素的(de)影(ying)響, 如(ru)普遍(bian)存在基(ji)質效應(ying)、交叉反應(ying)等(deng), 因而(er)檢測結果難(nan)以溯(su)源(yuan), 不(bu)同(tong)方(fang)法、不同試(shi)劑(ji)之間甚至(zhi)同壹試(shi)劑(ji)不(bu)同(tong)批(pi)號(hao)間結果均缺乏可比性。試(shi)劑(ji)質(zhi)量(liang)在(zai)很大程(cheng)度(du)上決(jue)定了(le)檢測的(de)水平, 因(yin)此(ci)在引入(ru)新(xin)項目(mu)之前必(bi)須對(dui)試(shi)劑(ji)進(jin)行(xing)嚴(yan)格(ge)的(de)評估(gu)。試(shi)劑(ji)的(de)評估(gu)有以下(xia)幾個步(bu)驟(zhou): (1) 確(que)定(ding)開展該(gai)項(xiang)目(mu)的(de)必(bi)要(yao)性(xing); (2) 了(le)解該(gai)項(xiang)目(mu)現(xian)有的(de)檢測方(fang)法和(he)原(yuan)理; (3) 在(zai)了(le)解試(shi)劑(ji)的(de)組(zu)成(cheng)基(ji)礎上(shang)選(xuan)擇(ze)多(duo)家(jia)試(shi)劑(ji)盒進行比較,判斷(duan)標(biao)準shou 選參(can)考(kao)方(fang)法或參(can)考(kao)物(wu)質, 其次(ci)為臨(lin)床的(de)滿意(yi)度(du)及權wei 機構的(de)報(bao)告(gao)如(ru)各(ge)級(ji)室(shi)間質(zhi)量評(ping)價、CDC 報(bao)告(gao)等(deng); (4) 定期對(dui)檢(jian)測結果進(jin)行(xing)追蹤(zong)反(fan)饋直(zhi)至(zhi)最(zui)終認(ren)可該(gai)試(shi)劑(ji)。

3、樣(yang)本(ben)因(yin)素

  標(biao)本(ben)幹擾因(yin)素包括內源性幹擾因(yin)素和(he)外(wai)源(yuan)性幹擾因(yin)素,前(qian)者(zhe)包括類(lei)風(feng)濕(shi)因子、補(bu)體、異(yi)嗜性(xing)抗(kang)體、自(zi)身抗(kang)體等(deng), 後者(zhe)包括標本溶(rong)血、標本(ben)被汙(wu)染(ran)、標本(ben)貯存時(shi)間過(guo)長、標(biao)本(ben)凝(ning)固(gu)不(bu)全(quan)、冷(leng)凍(dong)標本(ben)的(de)反復(fu)凍(dong)融(rong)等(deng)。其中(zhong)外(wai)源(yuan)性幹擾因(yin)素是(shi)我(wo)們(men)在檢測過(guo)程(cheng)中可以避(bi)免(mian)也(ye)是(shi)必(bi)須避(bi)免(mian)的(de)因素, 而(er)避(bi)免(mian)內源(yuan)性(xing)因(yin)素的(de)幹擾則(ze)主(zhu)要(yao)通(tong)過(guo)選(xuan)擇(ze)合(he)適的(de)試(shi)劑(ji)盒。在臨(lin)床中(zhong)遇到少見(jian)的(de)疑(yi)難(nan)病例時(shi)應(ying)當(dang)考(kao)慮(lv)到內源(yuan)性幹擾因(yin)素的(de)存在。以下(xia)對(dui)外(wai)源(yuan)性幹擾因(yin)素進(jin)行(xing)簡(jian)要(yao)說明:

  標(biao)本溶(rong)血　要(yao)註意避(bi)免(mian)出現(xian)嚴重溶(rong)血。血紅蛋(dan)白(bai)中(zhong)含(han)有(you)血紅素基(ji)團(tuan), 其(qi)具有類(lei)過(guo)氧化(hua)物(wu)的(de)活(huo)性(xing), 因此(ci), 在以辣(la)根(gen)過(guo)氧化(hua)物(wu)酶(ho rseradish peroxidase,HRP) 為標(biao)記(ji)酶的(de)ELISA 測定中(zhong), 如(ru)果血清標(biao)本(ben)中(zhong)血紅蛋(dan)白(bai)濃度(du)較高, 則(ze)其就很容易(yi)在(zai)溫育(yu)過(guo)程(cheng)中吸附(fu)於(yu)固(gu)相, 從而(er)與(yu)後(hou)面(mian)加(jia)入(ru)的(de)底(di)物反(fan)應(ying)顯(xian)色。

4、操(cao)作(zuo)因(yin)素對(dui)ELISA 結果的(de)影(ying)響

  ELISA 測定壹般(ban)遵(zun)循(xun)以下(xia)步(bu)驟(zhou): 固(gu)相包被→加(jia)樣品→溫育(yu)→洗(xi)滌→加(jia)酶結合物(wu)→溫育(yu)→洗(xi)滌→加(jia)底(di)物→溫育(yu)→顯(xian)色→終止(zhi)顯(xian)色→比色

目(mu)前(qian)各(ge)種(zhong)形(xing)式的(de)ELISA 自動(dong)分(fen)析(xi)儀(yi)已(yi)經(jing)進(jin)入(ru)市場, 如(ru)廣泛(fan)應(ying)用(yong)於(yu)血站系(xi)統(tong)的(de)微(wei)板式全自(zi)動(dong)酶(mei)免(mian)分(fen)析(xi)儀(yi), 其(qi)試(shi)劑(ji)為(wei)開(kai)放(fang)式的(de), 而對(dui)於(yu)其它(ta)類(lei)型的(de), 則(ze)試(shi)劑(ji)和(he)儀(yi)器(qi)往往是(shi)配(pei)套的(de)。但(dan)當(dang)前(qian)大部分(fen)醫(yi)學(xue)實驗室(shi)均采用(yong)手工操(cao)作(zuo)加(jia)儀器(qi)測定的(de)方(fang)式。ELISA 操(cao)作(zuo)步(bu)驟(zhou)復(fu)雜, 操(cao)作(zuo)不(bu)當(dang)將(jiang)引起(qi)較大的(de)誤(wu)差。以下(xia)敘(xu)述(shu)各(ge)個(ge)步(bu)驟(zhou)中(zhong)的(de)影(ying)響因(yin)素。加(jia)樣器(qi)是(shi)壹種(zhong)比較精(jing)密的(de)工具(ju), 其在(zai)長時(shi)間使(shi)用時(shi)會因(yin)機械磨損或(huo)者(zhe)推(tui)動(dong)桿(gan)內(nei)附(fu)著血痂(jia)等(deng)原因(yin)造成(cheng)加(jia)樣不(bu)準, 尤(you)其是(shi)對(dui)於(yu)樣本(ben)量(liang)較大的(de)臨(lin)床實驗室(shi), 因此(ci)必(bi)須定(ding)期對(dui)加(jia)液器(qi)進行維(wei)護和(he)校(xiao)準。每次(ci)加(jia)不同(tong)的(de)標本(ben)時(shi)均需更(geng)換(huan)吸嘴(zui), 以免(mian)發生交叉汙(wu)染(ran)。加(jia)樣時(shi)速(su)度(du)不可太(tai)快, 避(bi)免(mian)將(jiang)標本(ben)加(jia)在孔(kong)壁(bi)上部, 並註意不要(yao)濺(jian)出或(huo)產生氣泡(pao)。加(jia)樣時(shi)還應(ying)當(dang)註意操(cao)作(zuo)時(shi)差對(dui)結果的(de)影(ying)響, 操(cao)作(zuo)時(shi)差是(shi)指(zhi)加(jia)入(ru)標(biao)本、試(shi)劑(ji)及(ji)混(hun)勻(yun)時(shi)間的(de)差異(yi)。操(cao)作(zuo)時(shi)差在(zai)每個實驗中(zhong)都(dou)存在, 尤(you)其是(shi)手工操(cao)作(zuo), 日(ri)常(chang)檢(jian)測標本(ben)多(duo)達(da)幾百個,從(cong)加(jia)入(ru)第壹個(ge)標(biao)本(ben)到最(zui)後(hou)壹個(ge)標(biao)本(ben), 需幾十(shi)分(fen)鐘(zhong), 加(jia)入(ru)試(shi)劑(ji)及(ji)混(hun)勻(yun)等(deng)均存在著前後(hou)時(shi)間差(cha)異, 使(shi)抗(kang)原抗(kang)體反(fan)應(ying)和(he)酶(mei)促反(fan)應(ying)時(shi)間不(bu)壹致(zhi), 操(cao)作(zuo)時(shi)差對(dui)競(jing)爭(zheng)法檢測的(de)結果影(ying)響更(geng)大, 在加(jia)酶結合物(wu)和(he)底(di)物時(shi)可用(yong)定(ding)量多道(dao)。