在定(ding)量(liang)PCR（也(ye)稱(cheng)rt-PCR或qPCR）中，熒光信(xin)號(hao)是由(you)熒光探(tan)針(zhen)或熒光DNA結(jie)合(he)染(ran)料(liao)（如SYBR Green）產(chan)生(sheng)，其強度與(yu)PCR產(chan)物(wu)分子（擴增(zeng)子）的數(shu)量(liang)成正比(bi)。每(mei)個(ge)循(xun)環(huan)結束(shu)時，收(shou)集熒光信(xin)號(hao)強度(du)，通過將熒光強(qiang)度(du)與(yu)循(xun)環(huan)數作(zuo)圖(tu)，qPCR儀(yi)生(sheng)成擴增(zeng)曲線(xian)，其表(biao)示(shi)在整個(ge)PCR過(guo)程(cheng)中產(chan)物(wu)的累(lei)積(ji)，通過(guo)這(zhe)個過(guo)程，即可實現量(liang)化(hua)。如果(guo)樣(yang)品(pin)中特(te)定的序(xu)列（DNA或RNA）豐富(fu)，則(ze)在較(jiao)早的(de)循(xun)環(huan)中觀(guan)察到擴增(zeng)，Ct值小(xiao);如果(guo)序(xu)列稀少，則在稍(shao)後(hou)的循(xun)環(huan)中觀(guan)察到擴增(zeng)，Ct值大(da)。此SOP將涵蓋總RNA提取和(he)兩步法逆轉(zhuan)錄(lu)定(ding)量(liang)PCR（qRT PCR）的操(cao)作過(guo)程以(yi)及(ji)數(shu)據(ju)分析(xi)。

註意(yi)事(shi)項:

1、 所有步驟均(jun)應在超(chao)凈(jing)工(gong)作臺上進(jin)行，超(chao)凈(jing)臺紫外照(zhao)射至(zhi)少(shao)15min。

2、所有試(shi)劑應為此(ci)實驗(yan)專用。

3、使(shi)用75％乙醇(chun)或其他去(qu)汙劑擦(ca)拭(shi)工(gong)作臺，避免(mian)表(biao)面(mian)汙染(ran)。

4、 進(jin)入熒光定(ding)量(liang)PCR 操(cao)作實驗(yan)室後(hou)需(xu)要佩(pei)戴壹(yi)次(ci)性(xing)無(wu)菌(jun)口罩(zhao)、無(wu)菌(jun)乳膠(jiao)手套(tao)、實驗(yan)中盡量(liang)避免(mian)與(yu)同(tong)事交(jiao)談，防(fang)止PCR 模(mo)板(ban)汙染(ran)。

5、實驗(yan)中使(shi)用各種(zhong)規格(ge)的離(li)心(xin)管，槍(qiang)頭(tou)及(ji)配(pei)制試(shi)劑和(he)溶(rong)解(jie)沈(chen)澱(dian)用的水(shui)，均(jun)應焦碳酸二乙酯(zhi)（DEPC）處(chu)理後(hou)使(shi)用，以(yi)去(qu)除(chu)吸(xi)附的RNA酶汙染(ran)。

6、 使(shi)用Trizol試(shi)劑時(shi)，避(bi)免(mian)接(jie)觸皮膚或衣(yi)服。避(bi)免(mian)吸(xi)入蒸氣(qi)。

7、qPCR反(fan)應需(xu)要qPCR級水(shui)，試(shi)劑和(he)試(shi)管。請(qing)務必使(shi)用正確(que)類型(xing)的qPCR光學(xue)PCR管和(he)蓋子。不可(ke)用普通(tong)的(de)PCR管。

8、加樣(yang)前，先布(bu)局，規劃加樣(yang)順序(xu)以(yi)避(bi)免(mian)交(jiao)叉(cha)汙染(ran)。

9、所有實驗(yan)應均(jun)應設置無(wu)模(mo)板(ban)對(dui)照(zhao)，其中包含(han)除(chu)DNA或cDNA樣(yang)品(pin)以(yi)外(wai)的所有反應組(zu)分。

10、先(xian)配(pei)制qPCR反應混合液(ye)，減少(shao)誤(wu)差。

11、 加樣(yang)後上(shang)機前，務必(bi)通過瞬離(li)將反應液(ye)離(li)至(zhi)管底(di)，並(bing)消除(chu)溶(rong)液(ye)中的氣(qi)泡(pao)，因(yin)為氣(qi)泡會(hui)幹(gan)擾熒光檢測(ce)且降低(di)酶活(huo)性，從(cong)而(er)降低(di)擴增(zeng)效率。