基(ji)於(yu)PCR原理(li)三步(bu)驟(zhou)而(er)設置(zhi)變(bian)性-退火(huo)-延(yan)伸(shen)三個溫(wen)度點(dian)。在標準反應中采(cai)用三(san)溫(wen)度點(dian)法(fa)，雙鏈(lian)DNA在90～95℃變(bian)性，再(zai)迅(xun)速冷(leng)卻至(zhi)40 ～60℃，引(yin)物退火(huo)並(bing)結合(he)到(dao)靶(ba)序列(lie)上，然(ran)後快(kuai)速升溫(wen)至(zhi)70～75℃，在Taq DNA 聚合(he)酶的(de)作用下(xia)，使(shi)引(yin)物鏈(lian)沿(yan)模(mo)板延(yan)伸(shen)。對於(yu)較短(duan)靶基(ji)因(yin)（長(chang)度為(wei)100～300bp時(shi)）可(ke)采(cai)用二(er)溫(wen)度點(dian)法(fa)， 除(chu)變(bian)性溫(wen)度外、退火(huo)與延(yan)伸(shen)溫(wen)度可(ke)合(he)二為(wei)壹(yi)，壹(yi)般(ban)采(cai)用94℃變(bian)性，65℃左右退火(huo)與延(yan)伸(shen)（此(ci)溫(wen)度Taq DNA酶仍(reng)有(you)較(jiao)高的催化活性(xing)）。

1、變(bian)性溫(wen)度與時間(jian)：

變(bian)性溫(wen)度低(di)，解鏈(lian)不(bu)*是(shi)導致PCR失敗(bai)的(de)最主要(yao)原(yuan)因(yin)。壹(yi)般(ban)情況(kuang)下(xia)，93℃～94℃min足(zu)以(yi)使(shi)模(mo)板DNA變(bian)性，若(ruo)低於(yu)93℃則(ze)需(xu)延(yan)長(chang)時間(jian)，但溫(wen)度不(bu)能(neng)過(guo)高，因(yin)為(wei)高溫(wen)環(huan)境對(dui)酶的(de)活性(xing)有(you)影(ying)響。此(ci)步(bu)若(ruo)不(bu)能(neng)使(shi)靶(ba)基因(yin)模(mo)板或PCR產物*變(bian)性，就會(hui)導致PCR失敗(bai)。

2、退火(huo)（復(fu)性）溫(wen)度與時間(jian)：

退火(huo)溫(wen)度是(shi)影響PCR特異(yi)性的(de)較(jiao)重要(yao)因(yin)素。變(bian)性後溫(wen)度快(kuai)速冷(leng)卻至(zhi)40℃～60℃，可(ke)使(shi)引(yin)物和模板發生結合(he)。由於(yu)模板DNA 比引(yin)物復(fu)雜得(de)多，引(yin)物和模板之(zhi)間的(de)碰撞結合(he)機會(hui)遠遠高於(yu)模板互(hu)補(bu)鏈(lian)之(zhi)間的(de)碰撞。退火(huo)溫(wen)度與時間(jian)，取決於(yu)引(yin)物的(de)長(chang)度、堿(jian)基(ji)組(zu)成(cheng)及(ji)其(qi)濃(nong)度，還(hai)有(you)靶(ba)基序列(lie)的長(chang)度。對(dui)於(yu)20個核苷(gan)酸，G+C含(han)量(liang)約(yue)50%的(de)引(yin)物，55℃為(wei)選(xuan)擇最適(shi)退火(huo)溫(wen)度的(de)起(qi)點(dian)較為(wei)理(li)想(xiang)。引(yin)物的(de)復(fu)性溫(wen)度可(ke)通過(guo)以(yi)下(xia)公式幫助(zhu)選(xuan)擇合(he)適(shi)的溫(wen)度：

Tm值（解鏈(lian)溫(wen)度）=4(G+C)+2(A+T)

復(fu)性溫(wen)度=Tm值-(5～10℃）

在Tm值允(yun)許(xu)範(fan)圍(wei)內， 選擇較高的復(fu)性溫(wen)度可(ke)大(da)大減少引(yin)物和模板間的(de)非特異性(xing)結合(he)， 提(ti)高PCR反應的特異性。復(fu)性時(shi)間壹(yi)般(ban)為(wei)30～60sec，足(zu)以(yi)使(shi)引(yin)物與模板之(zhi)間*結合(he)。

3、延(yan)伸(shen)溫(wen)度與時間(jian)：Taq DNA聚合(he)酶的(de)生物學活性(xing)：

70～80℃ 150核苷(gan)酸/S/酶分(fen)子

70℃ 60核苷(gan)酸/S/酶分(fen)子

55℃ 24核苷(gan)酸/S/酶分(fen)子

高於(yu)90℃時， DNA合(he)成幾(ji)乎不(bu)能(neng)進行(xing)。

PCR反應的延(yan)伸(shen)溫(wen)度壹(yi)般(ban)選擇在70～75℃之(zhi)間，常(chang)用溫(wen)度為(wei)72℃，過(guo)高的延(yan)伸(shen)溫(wen)度不(bu)利(li)於(yu)引(yin)物和模板的結合(he)。PCR延(yan)伸(shen)反應的時間，可(ke)根(gen)據(ju)待擴增片段(duan)的長(chang)度而(er)定，壹(yi)般(ban)1Kb以內的DNA片段(duan)，延(yan)伸(shen)時間(jian)1min是(shi)足(zu)夠(gou) 的。3～4kb的(de)靶序列(lie)需(xu)3～4min；擴增10Kb需(xu)延(yan)伸(shen)至(zhi)15min。延(yan)伸(shen)時間(jian)過(guo)長(chang)會(hui)導致非特異性(xing)擴增帶(dai)的出(chu)現。對低濃(nong)度模(mo)板的擴增，延(yan)伸(shen)時間(jian)要(yao)稍(shao)長(chang)些。