大鼠細胞培養(yang)操(cao)作(zuo)步(bu)驟：

1、細(xi)胞傳代：

細胞密度(du)達到80-90%時即(ji)可(ke)傳代
①棄去(qu)培養(yang)上(shang)清，用PBS或生理鹽水(shui)清洗(xi)-2次(ci)；
②加入(ru)2ml0.25%（T25瓶），使覆蓋整(zheng)個(ge)瓶或皿(min)，蓋(gai)好放入(ru)培養(yang)箱(xiang)消(xiao)化(hua)；
③-2min後，顯(xian)微鏡(jing)下(xia)觀(guan)察(cha)細胞，若大部(bu)分細(xi)胞回縮(suo)且(qie)有少量(liang)細(xi)胞脫落，輕(qing)輕(qing)吹(chui)打下(xia)確認(ren)消(xiao)化(hua)情況(kuang)後加入(ru)*培養(yang)基(ji)終(zhong)止(zhi)消(xiao)化(hua)；若(ruo)細(xi)胞還是貼(tie)壁(bi)，放(fang)回培養(yang)箱(xiang)繼(ji)續(xu)消(xiao)化(hua)至可(ke)以(yi)輕(qing)輕(qing)吹打下(xia)為(wei)止(zhi)；
④將(jiang)細(xi)胞懸液000RPM左右(you)條件(jian)下(xia)離(li)心4min，棄上(shang)清；
⑤用新(xin)鮮(xian)培養(yang)基(ji)重(zhong)懸後加入(ru)培養(yang)瓶(ping)或(huo)皿(min)中(zhong)，T25培養(yang)瓶(ping)加6-8ml培養(yang)基(ji)；
⑥懸(xuan)浮(fu)細(xi)胞直(zhi)接(jie)離(li)心收集，細胞沈(chen)澱重(zhong)懸後分(fen)到新(xin)培養(yang)瓶(ping)中(zhong)。
2、細(xi)胞復蘇(su)：
①將(jiang)凍(dong)存(cun)管(guan)在(zai)37℃溫水(shui)中(zhong)快(kuai)速搖(yao)晃(huang)融(rong)化，時(shi)間(jian)min左右(you)，加入(ru)4-5ml培養(yang)基(ji)混勻。
②在(zai)000RPM左右(you)條件(jian)下(xia)離(li)心4min，棄上(shang)清,加-2ml培養(yang)基(ji)吹(chui)勻，將(jiang)細(xi)胞懸液加入(ru)培養(yang)瓶(ping)中(zhong)，補加適量(liang)培養(yang)基(ji)。
3、細(xi)胞凍(dong)存(cun)：

待(dai)細(xi)胞生長(chang)狀態良好時進行(xing)細胞凍(dong)存(cun)保(bao)種(zhong)
①棄去(qu)培養(yang)上(shang)清，用PBS或生理鹽水(shui)清洗(xi)-2次(ci)，加入(ru)mL 0.25%（T25瓶）
②-2min後，顯(xian)微鏡(jing)下(xia)觀(guan)察(cha)細胞，大部(bu)分細(xi)胞回縮(suo)且(qie)有少量(liang)細(xi)胞脫落，輕(qing)輕(qing)吹(chui)打下(xia)確認(ren)消(xiao)化(hua)情況(kuang)後加入(ru)*培養(yang)基(ji)終(zhong)止(zhi)消(xiao)化(hua)；
③將(jiang)細(xi)胞懸液000RPM左右(you)條件(jian)下(xia)離(li)心4min，棄上(shang)清，加ml凍(dong)存(cun)液重(zhong)懸細(xi)胞；
④將(jiang)凍(dong)存(cun)管(guan)放(fang)入(ru)程序(xu)降(jiang)溫(wen)盒，放(fang)入(ru)-80℃冰箱(xiang)，4小時後將(jiang)凍(dong)存(cun)管(guan)轉(zhuan)入(ru)液氮(dan)罐(guan)儲存(cun)。