1、選擇處(chu)於對數(shu)生長(chang)期(qi)的(de)細胞，在(zai)凍(dong)存前壹(yi)天*換液(ye)。將(jiang)多個(ge)培養瓶(ping)中(zhong)的(de)細胞培養液(ye)去掉，用0.25% yi 蛋(dan)白酶(mei)消化(hua)。適時(shi)去掉yi蛋(dan)白酶(mei)，加入(ru)少量新培養液(ye)。用吸(xi)管(guan)吸(xi)取(qu)培養液(ye)反復吹(chui)打瓶壁(bi)上(shang)的(de)細胞，使其成(cheng)為(wei)均勻分散的(de)細胞懸(xuan)液(ye)。懸浮(fu)生產(chan)細胞則(ze)不要(yao)消(xiao)化(hua)處(chu)理。然(ran)後將(jiang)細胞收(shou)集(ji)於離心管中(zhong)離心（1000r/min，10分鐘）。

2、去上(shang)清液(ye)，加入(ru)含(han)20%小(xiao)牛(niu)血(xue)清的*培養基(ji)，於4℃預(yu)冷(leng)15分鐘後，逐(zhu)滴加(jia)入(ru)已無菌的(de)DMSO或甘油(you)，用吸(xi)管(guan)輕(qing)輕吹(chui)打使細胞均勻，細胞濃度為3×106～1×107/mL之(zhi)間(jian)。

3、將(jiang)上(shang)述(shu)細胞分(fen)裝(zhuang)於安瓿或冷凍(dong)塑料(liao)管中(zhong)，安(an)瓿裝(zhuang)1～1.5mL在火(huo)焰(yan)噴(pen)燈上(shang)封口，封口處(chu)要(yao)*封閉，圓(yuan)滑無(wu)勾。冷凍(dong)管要(yao)將(jiang)蓋子蓋(gai)緊，並標記好(hao)細胞名稱(cheng)和(he)凍(dong)存日期(qi)，同(tong)時(shi)作(zuo)好(hao)登(deng)記(ji)（日期(qi)、細胞種(zhong)類(lei)及(ji)代次(ci)、凍存(cun)支數(shu)）。

4、將(jiang)裝(zhuang)好(hao)細胞的(de)安(an)瓿或凍存(cun)管裝(zhuang)入(ru)沙布(bu)袋內(nei)；置(zhi)於液(ye)氮容器(qi)頸(jing)口(kou)處(chu)存放(fang)過夜，次(ci)日轉(zhuan)入(ru)液(ye)氮中(zhong)。采用控(kong)制降(jiang)溫(wen)速(su)度的方(fang)法(fa)也(ye)可采用下(xia)列(lie)步驟：先(xian)將(jiang)安瓿置(zhi)入(ru)4℃冰(bing)箱(xiang)中(zhong)2～3小(xiao)時，再(zai)移(yi)至冰(bing)箱(xiang)冷(leng)凍(dong)室(shi)內(nei)3～4小(xiao)時(shi)（此(ci)步可省(sheng)略），再(zai)吊入(ru)液(ye)氮容器(qi)頸(jing)氣(qi)態(tai)部(bu)分(fen)存放2小時(shi)，蕞(zui)後沈(chen)入(ru)液(ye)氮中(zhong)。

細胞凍(dong)存(cun)在液(ye)氮中(zhong)可(ke)以長(chang)期(qi)保(bao)存(cun)，但(dan)為(wei)妥(tuo)善(shan)起(qi)見，凍(dong)存(cun)半(ban)年後，*取(qu)出(chu)壹(yi)只安瓿細胞復(fu)蘇(su)培養，觀(guan)察(cha)生長(chang)情況(kuang)，然(ran)後再(zai)繼續(xu)凍(dong)存(cun)。