壹、實驗原(yuan)理(li)

雙(shuang)縮(suo)脲(niao)（NH3CONHCONH3）是兩個分(fen)子(zi)脲(niao)經180℃左右加(jia)熱，放出(chu)壹個分(fen)子(zi)氨(an)後(hou)得到(dao)的產(chan)物(wu)。在強堿性(xing)溶液(ye)中，雙(shuang)縮(suo)脲(niao)與CuSO4形成(cheng)紫(zi)色(se)絡(luo)合物(wu)，稱(cheng)為(wei)雙(shuang)縮(suo)脲(niao)反(fan)應(ying)。凡具(ju)有兩個酰(xian)胺基(ji)或兩個直(zhi)接連接的肽鍵，或能(neng)過(guo)壹個中間(jian)碳(tan)原(yuan)子(zi)相(xiang)連的肽鍵，這(zhe)類化(hua)合物(wu)都(dou)有(you)雙(shuang)縮(suo)脲(niao)反(fan)應(ying)。

紫色(se)絡(luo)合物(wu)顏色(se)的深(shen)淺(qian)與蛋(dan)白(bai)質(zhi)濃度(du)成(cheng)正(zheng)比(bi)，而(er)與蛋白質(zhi)分(fen)子(zi)量(liang)及氨(an)基(ji)酸(suan)成(cheng)分(fen)無(wu)關，故(gu)可(ke)用(yong)來(lai)測定(ding)蛋白(bai)質(zhi)含量。測定(ding)範圍(wei)為(wei)1-10mg蛋(dan)白質(zhi)。幹(gan)擾這壹測定(ding)的物(wu)質(zhi)主(zhu)要有：硫酸(suan)銨(an)、tris緩沖(chong)液(ye)和(he)某(mou)些氨(an)基(ji)酸(suan)等。

此法的優點(dian)是較(jiao)快速，不(bu)同(tong)的蛋白(bai)質(zhi)產(chan)生(sheng)顏色(se)的深(shen)淺(qian)相(xiang)近，以及幹(gan)擾物(wu)質(zhi)少(shao)。主(zhu)要(yao)的缺(que)點是(shi)靈敏度(du)差(cha)。因此雙(shuang)縮(suo)脲(niao)法常用(yong)於需(xu)要快(kuai)速，但並(bing)不(bu)需要(yao)十分(fen)精確(que)的蛋白(bai)質(zhi)測定(ding)。

二、試劑與器材

1.試劑(ji)：

（1）標(biao)準(zhun)蛋(dan)白質(zhi)溶(rong)液(ye)：用(yong)標(biao)準(zhun)的結晶牛(niu)血(xue)清清(qing)蛋白(bai)（bsa）或標(biao)準(zhun)酪(lao)蛋白，配(pei)制(zhi)成(cheng)10mg/ml的標(biao)準(zhun)蛋(dan)白溶液(ye)，可(ke)用(yong)bsa濃度(du)1mg/ml的a280為(wei)0.66來(lai)校正其純(chun)度(du)。如(ru)有需(xu)要(yao)，標(biao)準(zhun)蛋(dan)白質(zhi)還(hai)可(ke)預(yu)先用(yong)微(wei)量凱(kai)氏定(ding)氮法測定(ding)蛋白(bai)氮含量，計(ji)算(suan)出(chu)其純(chun)度(du)，再(zai)根(gen)據其純(chun)度(du)，稱(cheng)量配制成(cheng)標(biao)準(zhun)蛋(dan)白質(zhi)溶(rong)液(ye)。牛(niu)血(xue)清清(qing)蛋白(bai)用(yong)H2O 或0.9%NaCl配(pei)制(zhi)，酪(lao)蛋白用(yong)0．05NaOH配制(zhi)。

（2）雙(shuang)縮(suo)脲(niao)試劑(ji)：稱(cheng)以1.50克硫酸(suan)銅(tong)（CuSO4•5H2O）和6.0克酒(jiu)石(shi)酸(suan)鉀鈉(na)（KNaC4H4O6•4H2O），用(yong)500毫升水(shui)溶(rong)解，在攪拌(ban)下(xia)加(jia)入300毫(hao)升10% NaOH溶液(ye)，用(yong)水(shui)稀(xi)釋到(dao)1升，貯存(cun)於(yu)塑料瓶中（或內(nei)壁塗(tu)以石蠟(la)的瓶中）。此試(shi)劑可(ke)保(bao)存(cun)。若(ruo)貯(zhu)存(cun)瓶中有黑(hei)色(se)沈澱出(chu)現，則(ze)需(xu)要(yao)重新(xin)配(pei)制(zhi)。

2.器材：

可(ke)見(jian)光(guang)分(fen)光(guang)光(guang)度(du)計(ji)、大(da)試管(guan)15支、旋(xuan)渦混合器等。

三(san)、操作方(fang)法

1、標(biao)準(zhun)曲(qu)線(xian)的測定(ding)：取12支(zhi)試管(guan)分兩組(zu)，分(fen)別(bie)加(jia)入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫(hao)升的標(biao)準(zhun)蛋(dan)白質(zhi)溶(rong)液(ye)，用(yong)水(shui)補足到(dao)1毫(hao)升，然後(hou)加(jia)入4毫(hao)升雙(shuang)縮(suo)脲(niao)試劑(ji)。充(chong)分搖(yao)勻後(hou)，在室溫（20～25℃）下(xia)放置(zhi)30分(fen)鐘，於(yu)540nm處進行比色(se)測定(ding)。用(yong)未加(jia)蛋白(bai)質(zhi)溶(rong)液(ye)的第(di)壹支試(shi)管作(zuo)為(wei)空(kong)白對照(zhao)液(ye)。取(qu)兩組(zu)測定(ding)的平均值(zhi)，以蛋白質(zhi)的含量為(wei)橫(heng)座(zuo)標(biao)，光吸(xi)收(shou)值(zhi)為(wei)縱座(zuo)標(biao)繪(hui)制(zhi)標(biao)準(zhun)曲(qu)線(xian)。

2、樣品的測定(ding)：取2～3個(ge)試管(guan)，用(yong)上(shang)述(shu)同(tong)樣的方法，測定(ding)未知(zhi)樣品的蛋白(bai)質(zhi)濃度(du)。註(zhu)意樣品濃度(du)不(bu)要超過10mg/ml。