激素(su)ELISA檢測(ce)試(shi)劑盒使用(yong)方(fang)法

壹(yi)、樣(yang)品(pin) DNA 的(de)制(zhi)備

1.用自選(xuan)方法純(chun)化(hua)樣(yang)品(pin)的(de) DNA，本試(shi)劑盒跟市(shi)場上(shang)大多數(shu)病(bing)毒(du) DNA提取試(shi)劑盒兼 容(rong)。也(ye)可以選(xuan)購(gou)本(ben)公司的(de)壹(yi)管式病(bing)毒(du) DNAout 或(huo)其升(sheng)級版柱式病(bing)毒(du) DNAout。本(ben) 試(shi)劑盒免費贈(zeng)送(song) 15 次(ci) DNA 病(bing)毒(du)裂解(jie)液試(shi)用(yong)裝(zhuang)（壹(yi)管式病(bing)毒(du) DNAout 的(de)成分(fen)）。

二(er)、引(yin)物的(de)制(zhi)備（在(zai)樣(yang)品(pin)制(zhi)備室進行(xing)）

2.按(an)引(yin)物標(biao)簽提示(shi)在(zai)裝(zhuang)引(yin)物幹(gan)粉的(de)管中直(zhi)接加入(ru)適量的超純(chun)水（加入量見引(yin)物試(shi)管(guan)上(shang)

的標(biao)簽），使得(de)兩(liang)條引(yin)物的(de)濃度均(jun)為(wei) 10μM（10 pmol/μL），然(ran)後(hou)各(ge)取 110μL 混合在(zai)壹(yi)起得 220μL，標註為引(yin)物混合物，放(fang)冰(bing)上(shang)待用(yong)。220μL 足夠(gou) 100 次(ci) qPCR 反(fan)應。

三(san)、稀釋(shi)陽(yang)性(xing)對(dui)照(zhao)（以 10E2-10E7 這 6 個(ge) 10 倍稀(xi)釋(shi)度為(wei)例(li)。由(you)於標準品(pin)濃度非常(chang)高(gao)，

因此下列(lie)稀釋(shi)操作壹(yi)定(ding)要(yao)在(zai)獨(du)立(li)的區(qu)域(yu)進行(xing)，千(qian)萬(wan)不能汙染(ran)樣(yang)品(pin)或(huo)本(ben)試(shi)劑盒的其他(ta)成 分(fen)）。為增加產(chan)品穩(wen)定(ding)性(xing)和(he)避免擴散傳染(ran)性(xing)病(bing)原(yuan)，本產(chan)品(pin)不提供活體樣(yang)品(pin)做(zuo)陽(yang)性(xing)對(dui)照(zhao)， 只提供可以直接使用(yong)的(de)長(chang)為 52bp 的(de) DN段(duan)作為(wei)陽(yang)性(xing)對(dui)照(zhao)。

3.標記(ji) 6 個(ge)離(li)心(xin)管，分(fen)別(bie)為 7，6，5，4，3，2。

4.用帶(dai)芯(xin)槍頭(tou)分(fen)別(bie)加入 45 μL 超(chao)純水（用帶芯(xin)槍頭(tou)，下同(tong)）。

5.在(zai) 7 號管中(zhong)加(jia)入 5 μL 1×10E8 拷(kao)貝(bei)/μL 的(de)陽(yang)性(xing)對(dui)照(zhao)，充分(fen)震(zhen)蕩(dang) 1 分(fen)鐘，得

1×10E7 拷(kao)貝(bei)/μL 的(de)陽(yang)性(xing)對(dui)照(zhao)。放(fang)冰(bing)上(shang)待用(yong)。

6.換(huan)槍頭(tou)，在(zai) 6 號管中(zhong)加(jia)入 5 μL 1×10E7 拷(kao)貝(bei)/μL 的(de)陽(yang)性(xing)對(dui)照(zhao)(上步(bu)稀(xi)釋(shi)所(suo)得(de))， 充(chong)分(fen)震(zhen)蕩(dang) 1 分(fen)鐘，得 1×10E6 拷(kao)貝(bei)/μL 的(de)陽(yang)性(xing)對(dui)照(zhao)。放(fang)冰(bing)上(shang)待用(yong)。

7.換(huan)槍頭(tou)，從(cong) 6 號管中(zhong)取 5 μL 1×10E6 拷(kao)貝(bei)/μL 的(de)陽(yang)性(xing)對(dui)照(zhao)到(dao) 5 號管中(zhong)，充(chong)分(fen)震(zhen) 蕩(dang) 1 分(fen)鐘，得 1×10E5 拷(kao)貝(bei)/μL 的(de)陽(yang)性(xing)對(dui)照(zhao)。放(fang)冰(bing)上(shang)待用(yong)。

8.換(huan)槍頭(tou)，從(cong) 5 號管中(zhong)取 5 μL 1×10E5 拷(kao)貝(bei)/μL 的(de)陽(yang)性(xing)對(dui)照(zhao)到(dao) 4 號管中(zhong)，得(de)

1×10E4 拷(kao)貝(bei)/μL 的(de)陽(yang)性(xing)對(dui)照(zhao)。放(fang)冰(bing)上(shang)待用(yong)。

9.重復(fu)上面(mian)的操(cao)作直(zhi)到(dao)得(de)到(dao) 6 個(ge)稀釋(shi)度的(de)陽(yang)性(xing)對(dui)照(zhao)。放(fang)冰(bing)上(shang)待用(yong)。

激素(su)ELISA檢測(ce)試(shi)劑盒實(shi)驗(yan)步(bu)驟(zhou)

壹(yi)、懸浮細胞的(de)染(ran)色(se)

將(jiang)正(zheng)常(chang)培(pei)養和(he)誘(you)導(dao)雕亡的(de)懸浮細胞（0.5~1×106）用(yong)PBS洗(xi)2次(ci)，加入(ru)100 ul Binding Buffer和FITC標(biao)記的Annexin-V（20 ug/ml）10 ul，室溫(wen)避光30 min，再(zai)加(jia)入PI（50 ug/ml）5 ul，避(bi)光反(fan)應5 min後(hou)，加(jia)入(ru)400 ul Binding Buffer，立即用FACScan進(jin)行(xing)流(liu)式細(xi)胞(bao)術定(ding)量(liang)檢測(ce)（壹(yi)般(ban)不超過(guo)1 h）， 同(tong)時以不加AnnexinV-FITC及PI的壹(yi)管作為(wei)陰(yin)性(xing)對(dui)照(zhao)。
 
二(er)、貼(tie)壁培(pei)養的(de)細胞染色

先用(yong)0.25%的(de)消化(hua)，洗(xi)滌(di)、染(ran)色和分(fen)析同(tong)懸浮細胞。

三(san)、 爬片(pian)細胞(bao)染色

同(tong)上(shang)，*後(hou)用(yong)熒光顯(xian)微(wei)鏡(jing)和(he)共(gong)聚焦激光掃(sao)描顯(xian)微(wei)鏡(jing)進(jin)行(xing)觀(guan)察。