步(bu)驟：

（1）冷(leng)凍(dong)前(qian)24-48小(xiao)時(shi)更換半量或(huo)全量培養基(ji)，使細(xi)胞(bao)處於(yu)指數生長(chang)期(qi)。

（2）配制(zhi)冷(leng)凍保存(cun)溶液(使(shi)用(yong)前配制(zhi))：另(ling)取(qu)壹離心管，加入培養基(ji)、血清，逐滴加(jia)入二(er)甲基(ji)亞碸（DMSO）至20%濃度，即制(zhi)成(cheng)雙倍的凍(dong)存(cun)液(ye)，置(zhi)於(yu)室(shi)溫(wen)下(xia)待用。

（3）離心收(shou)集(ji)培(pei)養之(zhi)細(xi)胞(bao)，用加血清的培養基(ji)重懸(xuan)起(qi)細(xi)胞(bao)，取(qu)少量細(xi)胞(bao)懸(xuan)浮液(約(yue)0.1ml)計數細(xi)胞(bao)濃度及凍(dong)前(qian)存活(huo)率(lv)。

（4）取(qu)與(yu)細(xi)胞(bao)懸(xuan)液(ye)等量的凍(dong)存(cun)液，緩慢(man)逐滴加(jia)入細(xi)胞(bao)懸(xuan)液(ye)，並晃(huang)動(dong)試管，制(zhi)成(cheng)細(xi)胞(bao)凍存懸(xuan)液(ye)（DMSO最後濃度為(wei)5～10％），使細(xi)胞(bao)濃度為(wei)1～5×106cells/ml，混(hun)合均勻，分(fen)裝於已(yi)標(biao)示(shi)全之冷凍保存(cun)管中，1～2ml/vial，並(bing)取(qu)少量細(xi)胞(bao)懸(xuan)浮液作汙(wu)染(ran)檢測(ce)。嚴(yan)密(mi)封(feng)口(kou)後(hou)，註(zhu)明(ming)細(xi)胞(bao)名稱(cheng)、代數、日期。然後進(jin)行凍存(cun)。

註意事項：

（1）欲(yu)冷凍(dong)保存(cun)之(zhi)細(xi)胞(bao)應在生長(chang)良好(hao)(logphase)且(qie)存活(huo)率(lv)高之狀(zhuang)態(tai)，約(yue)為80～90％致密(mi)度。冷(leng)凍前(qian)檢(jian)測(ce)細(xi)胞(bao)是否仍保有(you)其te有(you)性質(zhi)，例(li)如hybridoma應(ying)在冷(leng)凍(dong)保存(cun)前(qian)壹至二(er)日測(ce)試是否有(you)抗體(ti)之產(chan)生。

（2）細(xi)胞(bao)在液(ye)氮中可長(chang)期(qi)凍(dong)存(cun)無(wu)限shi間(jian)，而不(bu)會影響細(xi)胞(bao)活力(li)；在-70度可(ke)保存(cun)數月。

（3）註(zhu)意冷凍保護劑之(zhi)品(pin)質(zhi)。DMSO應(ying)為(wei)試劑級等(deng)級，無(wu)菌(jun)且(qie)無(wu)色(以0.22micron　FGLP　Telflon過(guo)濾(lv)或(huo)是(shi)直接(jie)購買(mai)無(wu)菌(jun)產品(pin)，如Sigma D-2650)，以5～10ml小(xiao)體(ti)積分裝，4℃避光(guang)保存(cun)，勿(wu)作(zuo)多次解(jie)凍(dong)。Glycerol亦(yi)應(ying)為試劑級等(deng)級，以高壓(ya)蒸汽(qi)滅(mie)菌(jun)後避光(guang)保存(cun)。在開(kai)啟(qi)後壹年內使(shi)用，因長(chang)期(qi)儲(chu)存(cun)後對細(xi)胞(bao)會有(you)毒性(xing)。本方(fang)法(fa)中(zhong)先(xian)制(zhi)備(bei)雙倍凍存(cun)液(ye)，可(ke)避免DMSO直接(jie)加入時釋(shi)放的(de)熱(re)量對細(xi)胞(bao)的損傷。緩慢(man)逐滴加(jia)入細(xi)胞(bao)懸(xuan)液(ye)是使細(xi)胞(bao)逐步(bu)適應高滲(shen)，可降(jiang)低細(xi)胞(bao)受損。DMSO可能(neng)引(yin)起(qi)部(bu)分(fen)白血病細(xi)胞(bao)株的分化，可換用10%甘(gan)油(you)凍(dong)存(cun)。