PCR反(fan)應(ying)產(chan)物(wu)的特異(yi)性(xing)由壹(yi)對上(shang)下(xia)遊引物(wu)所(suo)決定(ding)。引物(wu)的好(hao)壞(huai)往(wang)往(wang)是(shi)PCR成敗的(de)關鍵。引(yin)物(wu)設計(ji)和(he)選(xuan)擇目的DNA序(xu)列(lie)區域(yu)時可遵(zun)循(xun)下列(lie)原(yuan)則：
 

　　1、引物(wu)長度(du)約為(wei)16-30 bp， 太(tai)短(duan)會(hui)降低(di)退(tui)火溫(wen)度(du)影(ying)響(xiang)引物(wu)與模板(ban)配(pei)對，從而(er)使(shi)非特異(yi)性(xing)增(zeng)高。太(tai)長則比較浪費(fei)，且難以合(he)成(cheng)。
 

　　2、引(yin)物(wu)中(zhong)G+C含(han)量(liang)通常為(wei)40%-60%，可按(an)下式粗(cu)略(lve)估計(ji)引物(wu)的解(jie)鏈溫(wen)度(du) Tm=4(G+C)+2(A+T)。
 

　　3、四(si)種堿(jian)基應(ying)隨(sui)機分(fen)布，在3'端(duan)不(bu)存(cun)在(zai)連(lian)續3個G或C，因這樣易(yi)導致錯誤(wu)引(yin)發(fa)。
 

　　4、引(yin)物(wu)3'端最(zui)好(hao)與目的序(xu)列(lie)閱讀框(kuang)架中(zhong)密碼(ma)子第壹(yi)或第二位(wei)核(he)苷酸對(dui)應， 以減(jian)少由於密碼(ma)子擺(bai)動產(chan)生的不(bu)配(pei)對。
 

　　5、在引(yin)物(wu)內(nei)， 尤其在(zai)3'端(duan)應(ying)不(bu)存(cun)在(zai)二(er)級結構。
 

　　6、兩引物(wu)之間(jian)尤其在(zai)3'端(duan)不(bu)能(neng)互(hu)補， 以防出(chu)現引物(wu)二聚體(ti)， 減(jian)少產(chan)量。兩引物(wu)間最(zui)好(hao)不(bu)存(cun)在(zai) 4個(ge)連(lian)續堿(jian)基的(de)同(tong)源性(xing)或互(hu)補性(xing)。
 

　　7、引物(wu)5'端對(dui)擴增(zeng)特異(yi)性(xing)影(ying)響(xiang)不(bu)大(da)， 可在引(yin)物(wu)設計(ji)時加上(shang)限(xian)制(zhi)酶(mei)位(wei)點(dian)、核(he)糖(tang) 體(ti)結(jie)合(he)位(wei)點(dian)、起始密碼(ma)子、缺(que)失或插入(ru)突(tu)變(bian)位(wei)點(dian)以及(ji)標(biao)記(ji)生物(wu)su、熒光(guang)素等(deng)。通常應(ying)在(zai)5'端限制(zhi)酶(mei)位(wei)點(dian)外再加(jia)1-2個保護堿(jian)基。
 

　　8、引(yin)物(wu)不(bu)與模板(ban)結合(he)位(wei)點(dian)以外(wai)的(de)序(xu)列(lie)互(hu)補。所(suo)擴增(zeng)產(chan)物(wu)本(ben)身(shen)無穩定(ding)的二(er)級結構(gou)， 以免(mian)產(chan)生非特異(yi)性(xing)擴增(zeng)，影(ying)響(xiang)產(chan)量。
 

　　9、簡並引物(wu)應選(xuan)用(yong)簡並程度(du)低(di)的(de)密碼(ma)子， 例(li)如(ru)選(xuan)用(yong)只有(you)壹(yi)種密碼(ma)子的Met， 3'端(duan)應(ying)不(bu)存(cun)在(zai)簡並性(xing)。否則可能(neng)由於產(chan)量低(di)而(er)看不(bu)見(jian)擴增(zeng)產(chan)物(wu)。
 

　　10、壹(yi)般PCR反(fan)應(ying)中(zhong)的(de)引(yin)物(wu)終濃(nong)度(du)為0.2-1.0 μmol/L。引(yin)物(wu)過(guo)多會(hui)產(chan)生錯誤(wu)引(yin)導或產(chan)生引物(wu)二聚體(ti)， 過(guo)低(di)則降低(di)產(chan)量。利用(yong)紫外分(fen)光(guang)光(guang)度(du)計， 可精確(que)計(ji)算引物(wu)濃(nong)度(du)， 在1cm光(guang)程比色(se)杯中(zhong)，260nm下(xia)，引(yin)物(wu)濃(nong)度(du)可按(an)下式計算：
 

　　X mol/L= OD260/A(16000)+C(70000)+G(12000)+T(9600)
 

　　X： 引物(wu)摩爾濃(nong)度(du)，A、C、G、T：引物(wu)中(zhong)4種(zhong)不(bu)同(tong)堿(jian)基個(ge)數(shu)。