細(xi)胞凍存是細(xi)胞保(bao)存的主要(yao)方法(fa)之壹(yi)。利(li)用(yong)凍存技術將細(xi)胞置於-196℃液(ye)氮(dan)低溫保(bao)存，可(ke)以(yi)使細(xi)胞暫時(shi)脫(tuo)離(li)生(sheng)長(chang)狀態而將(jiang)細(xi)胞特性(xing)保(bao)存起(qi)來(lai)，這(zhe)樣(yang)在(zai)需(xu)要(yao)的時(shi)候(hou)再復(fu)蘇細(xi)胞用於(yu)實(shi)驗。適(shi)度(du)的(de)保(bao)存壹定量的(de)細(xi)胞，可(ke)以(yi)防(fang)止(zhi)因正(zheng)在(zai)培(pei)養的細(xi)胞被汙染(ran)或其他意(yi)外(wai)事件(jian)而(er)使細(xi)胞丟種，起(qi)到(dao)細(xi)胞保(bao)種的(de)作用(yong)。

貼(tie)壁細(xi)胞凍存操作(zuo)步驟：

1. 制備凍存液，凍(dong)存液比(bi)例：實驗(yan)室(shi)采(cai)用90% FBS+10% DMSO；

2. 取(qu)形(xing)態良好(hao)，處(chu)於對(dui)數(shu)生(sheng)長(chang)期(qi)的細(xi)胞，吸出(chu)舊培養基，加PBS沖(chong)洗(xi)壹(yi)次；

3. yi酶(mei)消化(hua)細(xi)胞，鏡下觀(guan)察(cha)細(xi)胞，待細(xi)胞全變(bian)圓(yuan)後(hou)，加(jia)全(quan)培養(yang)基終止(zhi)消化(hua)，800g離心(xin)5min收(shou)集(ji)細(xi)胞；

4. 棄去離心(xin)管上(shang)清(qing)液，加(jia)入凍存液重(zhong)懸(xuan)細(xi)胞，小(xiao)心(xin)打(da)開(kai)凍存管管蓋(gai)，每(mei)管分(fen)裝(zhuang)1-1.5mL含細(xi)胞的凍(dong)存液，擰(ning)緊(jin)蓋管，做(zuo)好(hao)標記；

5. 分(fen)裝(zhuang)好的(de)凍(dong)存管轉入程序降溫(wen)盒後(hou)直(zhi)接放(fang)-80℃過(guo)夜(ye)；

6. 若(ruo)沒有(you)程序(xu)降溫(wen)盒，則(ze)按下列(lie)順序(xu)依次降溫(wen)：

室(shi)溫→4℃20min→-20℃30min→-80℃過(guo)夜(ye)，註意(yi)轉移(yi)過(guo)程(cheng)中(zhong)要(yao)保(bao)冷，避免產(chan)生溫差或(huo)凍(dong)存管融(rong)化(hua)；

7. 從-80℃冰(bing)箱取(qu)出(chu)凍存管迅速(su)轉移(yi)到液氮(dan)長(chang)期(qi)保(bao)存。

註意(yi)事(shi)項：

1. 必(bi)須(xu)始(shi)終(zhong)穿戴適(shi)當(dang)的(de)個(ge)人防護(hu)設(she)備，手套汙染(ran)時(shi)應當(dang)更(geng)換(huan)，將用(yong)過(guo)的(de)手(shou)套(tao)與其他汙染(ran)的實(shi)驗室(shi)廢物壹起(qi)處(chu)置。

2. 實驗(yan)前(qian)和實驗(yan)後(hou)需(xu)要(yao)滅菌處理，實驗前(qian)，實(shi)驗(yan)臺(tai)打(da)開(kai)紫外(wai)燈照射20-30分(fen)鐘(zhong)，實(shi)驗(yan)後(hou)需(xu)要(yao)用75%酒(jiu)精(jing)擦(ca)拭超凈臺、邊(bian)臺(tai)、倒(dao)置鏡的載物(wu)臺(tai)。

3. 凡是帶(dai)入超凈工(gong)作臺(tai)內(nei)的(de)酒(jiu)精(jing)、PBS、培養(yang)基(ji)、 yi蛋(dan)白(bai)酶(mei)的瓶子(zi)均(jun)要(yao)75％酒(jiu)精(jing)擦(ca)拭瓶子的外(wai)表(biao)面(mian)，靠(kao)近酒(jiu)精(jing)燈火(huo)焰(yan)操(cao)作。

4. 凍存時(shi)細(xi)胞濃(nong)度(du)低於1-5×106個(ge)/ml。

5. 凍(dong)存前(qian)註意(yi)切(qie)勿消化(hua)時(shi)間(jian)過(guo)長(chang)、吹(chui)打(da)力(li)度(du)過(guo)重(zhong)、離(li)心(xin)轉速(su)過(guo)大(da)或(huo)離(li)心(xin)時(shi)間(jian)過(guo)長(chang)，以(yi)免(mian)造成(cheng)細(xi)胞損(sun)傷(shang)。

6. 凍(dong)存細(xi)胞長(chang)期(qi)保(bao)存應放(fang)置於液(ye)氮(dan)，不(bu)建議(yi)在(zai)-80℃長(chang)期(qi)保(bao)存。

7. 細(xi)胞離心(xin)後(hou)盡(jin)量吸幹凈(jing)上清(qing)液，減(jian)少培養(yang)基(ji)殘留，避(bi)免稀(xi)釋凍存液。

8. DMSO溶(rong)於培養(yang)基(ji)時(shi)，將(jiang)釋放大(da)量熱(re)量，所(suo)以(yi)細(xi)胞凍存液需(xu)提前(qian)配制，冷卻後(hou)再使用(yong)，不(bu)能(neng)直接將(jiang)DMSO加入含有(you)細(xi)胞的培(pei)養(yang)基中(zhong)，避(bi)免(mian)燙(tang)傷(shang)細(xi)胞。